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生长激素促泌素受体1a(growth hormone secretagogue receptor,GHS-R1a)是营养素感应性胃肠肽ghrelin的公认受体,在下丘脑及下丘脑以外、与记忆和情绪调控密切相关的脑区(海马、皮层和杏仁核等)均有较丰富的表达,提示这些脑区的GHS-R1a参与调控学习记忆、焦虑及抑郁情绪等,并可能与多种认知和情感障碍性神经精神疾病的病理生理相关。除被ghrelin激活外,GHS-R1a还具有很高的、配体非依赖性自发活性。虽然以往的研究已报道ghrelin对学习记忆具有调节作用,但结论相互矛盾。迄今为止,ghrelin和GHS-R1a参与记忆调控的具体机制仍不清楚。正常生理状态下,中枢神经系统内源性ghrelin的含量是微乎其微的,GHS-R1a的自发活性可能是其调控神经元功能的重要方式之一。在前期研究中,我们发现Ghsr1a基因全敲除(Ghsr1a KO)降低海马dCA1区GAD67~+抑制性神经元的兴奋性,小鼠表现出海马依赖的记忆增强。而海马dCA1区αCaMKII~+兴奋性神经元中GHS-R1a过表达抑制锥体神经元的兴奋性,同时小鼠表现出空间记忆和位置记忆障碍。因此我们推测GHS-R1a激活差异性调节海马兴奋性和抑制性神经元的活动,这种神经元类型特异性调节作用可能是GHS-R1a参与记忆调控的关键。为深入探究GHS-R1a对学习记忆的调节作用,本课题拟在前期研究基础上,通过脑立体定位仪将pAAV-hSyn-DIO-Ghsr1a-EGFP病毒和对照病毒分别注射到Camk2a-Cre、Vglut1-Cre以及Dlx5/6-Cre小鼠海马dCA1区,以选择性在海马兴奋性/抑制性神经元内过表达GHS-R1a,考察其对海马依赖性学习记忆的影响。采用的行为学范式包括高架十字迷宫(EPM)、旷场实验(OF)、新物体识别实验(NOR)、新位置识别实验(NPR)、Morris水迷宫(MWM)。同时,我们将化学遗传病毒pAAV-Camk2a-HA-h M4D(Gi)-2A-Ghsr1a-sfGFP和对照病毒分别注射到小鼠海马dCA1区,通过腹腔注射叠氮平-N-氧化物(clozapine-N-oxide,CNO)失活病毒感染的Ghsr1a过表达神经元,考察可逆性失活过表达GHS-R1a的dCA1区αCaMKII~+神经元对小鼠记忆提取或检索的影响,并对可能的海马微环路机制进行了初步探讨。具体实验结果如下:1.海马dCA1区αCaMKII~+或VGLUT1~+兴奋性神经元过表达GHS-R1a损害小鼠海马依赖性学习记忆。1.1.NOR记忆测试结果显示,海马dCA1区αCaMKII~+或VGLUT1~+兴奋性神经元GHS-R1a过表达损害小鼠的物体识别记忆。具体表现为GHS-R1a过表达病毒注射组Camk2a-Cre小鼠探索新物体的时间与对照病毒注射组Camk2a-Cre小鼠相比明显缩短。与对照病毒注射组Vglut1-Cre小鼠相比,过表达病毒注射组Vglut1-Cre小鼠探索新、旧物体的时间无显著差异,说明小鼠有物体识别记忆障碍。各组小鼠探索新、旧物体的总时间无差别,说明GHS-R1a过表达不影响小鼠对物体的自主探索行为。1.2.NPR记忆测试结果显示,海马dCA1区αCaMKII~+兴奋性神经元GHS-R1a过表达损害小鼠的物体位置识别记忆。具体表现为与对照病毒注射组小鼠相比,过表达病毒注射组小鼠探索新位置、旧位置物体的时间无显著差异,说明小鼠有位置识别记忆障碍。各组小鼠探索新、旧位置物体的总时间无差别,说明GHS-R1a过表达不影响小鼠对物体位置的自主探索行为。1.3.MWM空间记忆测试结果显示,海马dCA1区αCaMKII~+或VGLUT1~+兴奋性神经元GHS-R1a过表达损害小鼠的空间记忆。具体表现为过表达病毒注射组Camk2a-Cre小鼠在目标象限的探索时间百分比与其他象限相比无显著差异,而对照病毒注射组Camk2a-Cre小鼠在目标象限探索时间百分比远大于其他象限,说明海马dCA1区αCaMKII~+神经元GHS-R1a过表达损害小鼠的空间记忆。同样,VGLUT1~+神经元GHS-R1a过表达也损害小鼠的空间记忆,过表达组小鼠在目标象限的探索时间百分比与其他象限相比无差别,而对照小鼠在目标象限的探索时间百分比远大于其他象限。各组小鼠找寻平台的潜伏时间和游泳速度无显著差异,说明GHS-R1a过表达不影响小鼠的学习和协调性运动。1.4.EPM和OF测试结果显示,海马dCA1区αCaMKII~+、VGLUT1~+兴奋性神经元GHS-R1a过表达不影响小鼠的基础焦虑和自发活动。具体表现为过表达病毒注射组小鼠和对照病毒注射组小鼠在高架十字迷宫开放臂和闭合臂停留的时间、旷场四周和中央区域探索的时间均无显著差别,说明兴奋性神经元GHS-R1a过表达不影响小鼠的自发活动和基础焦虑,因此GHS-R1a过表达对海马依赖性记忆的影响与小鼠的自发活动及情绪变化等无关。2.海马dCA1区DLX5/6~+抑制性神经元GHS-R1a过表达促进小鼠海马依赖性学习记忆。2.1.NPR记忆测试结果显示,海马dCA1区DLX5/6~+抑制性神经元GHS-R1a过表达促进小鼠的物体位置识别记忆。具体表现为过表达病毒注射组小鼠探索新位置物体的时间远长于探索旧位置物体的时间,而对照病毒注射组小鼠在同样的训练条件下,探索新、旧位置物体的时间相比尚无明显区别。两组小鼠探索新、旧位置物体的总时间无差别。2.2.MWM空间记忆测试结果显示,海马dCA1区DLX5/6~+抑制性神经元GHS-R1a过表达提高小鼠的空间记忆。具体表现为在第7天的记忆测试时,与对照组小鼠相比,过表达组小鼠在目标象限的探索时间百分比远大于其他象限。两组小鼠找寻平台的潜伏时间和游泳速度无显著差异。2.3.EPM和OF实验结果显示,海马dCA1区DLX5/6~+神经元GHS-R1a过表达不影响小鼠的自发活动和基础焦虑。具体表现为两组小鼠在高架十字迷宫开放臂和闭合臂停留的时间、旷场四周和中央区域探索的时间均无显著差别,说明DLX5/6~+抑制性神经元GHS-R1a过表达对小鼠海马依赖性记忆的增强作用与小鼠的自发活动及情绪改变等无关。3.化学遗传可逆性失活海马dCA1区GHS-R1a过表达的αCaMKII~+神经元对小鼠记忆检索或提取的影响。3.1.NOR记忆测试结果显示,海马dCA1区αCaMKII~+神经元GHS-R1a过表达损害小鼠的物体识别记忆。记忆测试前腹腔注射CNO失活病毒感染的αCaMKII~+神经元可抑制对照病毒注射组小鼠物体识别记忆的提取。具体表现为NOR测试前45分钟注射CNO后,对照组小鼠新、旧物体的探索时间无明显差别。3.2.NPR记忆测试结果显示,海马dCA1区αCaMKII~+神经元GHS-R1a过表达损害小鼠的物体位置识别记忆,强化训练消除GHS-R1a过表达对位置识别记忆的抑制作用。记忆测试前腹腔注射CNO失活病毒感染的αCaMKII~+神经元可抑制对照病毒注射组小鼠位置识别记忆的提取,对GHS-R1a过表达病毒注射组小鼠的记忆提取无影响。具体表现为NPR测试前45分钟注射CNO,对照组小鼠对新位置物体的探索时间明显减少,新、旧位置物体的探索时间无明显差别,而GHS-R1a过表达组小鼠对新位置物体的探索时间仍旧显著长于对旧位置物体的探索时间。3.3.MWM空间记忆测试结果显示,海马dCA1区αCaMKII~+神经元GHS-R1a过表达损害小鼠的空间记忆,强化训练消除GHS-R1a过表达对空间记忆的抑制作用。腹腔注射CNO抑制对照病毒注射组小鼠空间记忆的提取,但不影响过表达病毒注射组小鼠空间记忆的提取。具体表现为MWM测试前注射CNO与注射生理盐水相比,GHS-R1a过表达小鼠在目标象限探索时间百分比无明显变化,但CNO注射后对照病毒注射小鼠在目标象限探索的时间百分比明显降低。综上所述,我们发现海马dCA1区αCaMKII~+、VGLUT1~+兴奋性神经元GHS-R1a过表达抑制小鼠记忆获取,而DLX5/6~+抑制性神经元GHS-R1a过表达增强小鼠海马依赖的记忆获取,表明dCA1区兴奋性锥体神经元和抑制性中间神经元GHS-R1a激活对学习记忆具有相反的调节作用。强化训练可以消除GHS-R1a过表达对海马依赖性记忆的抑制作用。化学遗传手段失活海马dCA1区过表达GHS-R1a的αCaMKII~+神经元不影响小鼠记忆的提取,说明相关记忆并没有存储在这部分神经元,也就是说这部分过表达GHS-R1a的神经元可能没有参与记忆编码。与之不同,我们发现失活对照小鼠dCA1区αCaMKII~+神经元(无GHS-R1a过表达)则抑制相关记忆的提取,说明这部分αCaMKII~+神经元参与了相关记忆的编码,即这部分αCaMKII~+神经元是海马CA1区神经网络中的记忆神经元。因此,我们的研究结果提示GHS-R1a在dCA1区部分αCaMKII~+神经元的过表达限制了这部分神经元参与相关记忆的编码,这一作用可能与GHS-R1a过表达抑制神经元兴奋性密切相关。GHS-R1a过表达使得邻近的GHS-R1a表达较少的神经元、甚至其它脑区的神经元更容易参与相关记忆编码,因此CNO注射失活此类GHS-R1a过表达的αCaMKII~+神经元不影响小鼠记忆的提取或检索。通过以上研究,我们认为GHS-R1a通过作用于海马不同类型神经元(兴奋性/抑制性)实现对海马神经环路活动和记忆行为的精细调控。GHS-R1a对海马依赖性记忆编码的调控作用与其对神经元兴奋性的调控作用密切相关。这些创新性发现不仅加深了我们对ghrelin和GHS-R1a多重生理功能及机制的理解,而且为靶向GHS-R1a改善记忆药物的开发提供理论依据。