研究背景食管癌(Esophageal carcinoma)是一种临床常见的恶性肿瘤,起源于食管上皮,主要的组织类型为鳞癌和腺癌。在我国90%的食管癌为鳞状细胞癌,腺癌只占不到10%。男性患病率高于女性,多在40岁以上发病。由于人食管解剖结构的特点,其预后较差,整体生存率低于10%,术后5年生存率约20%-40%。我国是食管癌高发区之一,同时也是高死亡率国家之一,大约每年有15万人死于食管癌,占癌症总死亡率的23.53%。食管癌的早期症状多不明显,一旦出现典型临床症状,多数错过了最佳治疗时机。目前认为食管癌是一种多因素作用、多基因相关、多阶段发展的疾病,尽管众多学者做了大量研究,仍未阐明其确切发病机制。鉴于其生存率低,预后差,因此早期识别食管癌就显得尤为重要。上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是促进肿瘤侵袭转移的主要作用机制之一。EMT是具有极性的上皮细胞转换成能够在细胞基质间自由移动的细胞过程,其转变的主要特征在于原来的细胞失去上皮细胞特性,转而表达间质细胞的特性。在肿瘤转移过程中,癌细胞通过EMT实现对周围组织的浸润；到达种植部位后,癌细胞通过间质-上皮转化(Mesenchymal-epithelial transition, MET)最终形成与原发灶在形态结构上相似的转移灶。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase, MMP)是一组由结缔组织分泌依赖Zn2+的能够降解细胞外基质的蛋白酶家族,到目前为止共发现28个成员。目前研究表明MMP参与了血管基底膜的降解及细胞外基质的重塑过程,从而导致内皮细胞能够侵袭、转移到周围组织并促进肿瘤血管的生成。正是这一过程导致了肿瘤远处转移率的增高,也是促进肿瘤侵袭、转移的关键。ZEB(Zinc finger E-box binding protein)即E盒锌指结合蛋白,其家族成员包括ZEB1 (zinc-finger E-box binding homeobox 1)和ZEB2 (zinc-finger E-box binding homeobox 2)2种。ZEB2能够诱导肿瘤细胞向具有高侵袭、高转移能力的间质表型转变,从而使肿瘤细胞丧失上皮细胞特性的标志物,获得间叶细胞特性的标志物。另有研究表明ZEB2是通过与靶基因启动子区的E-box结合,从而抑制上皮细胞特性标志物如细胞间E-钙黏附蛋白(E-cadherin)、紧密连接蛋白(claudin)、间隙连接蛋白(connexin)、桥粒斑蛋白(desmoplakin)等靶基因的转录,导致上皮细胞极性的丧失和细胞间连接的减少。与此同时,过高表达的ZEB2可以促进间质性标志物如波形蛋白(vimentin)、纤维连接蛋白(fibronectin)、MMP的表达,诱导EMT的发生,从而促进肿瘤细胞的侵袭、转移。Hedgehog信号通路包括配体Hh、胞膜受体Ptch和Smo、下游转录因子Gli、Hip(负性调节因子)和SuFu (Fu抑制因子)。跨膜蛋白Ptch和Smo形成受体复合物与Hedgehog结合后,Smo构象发生改变,解除了Ptch对其的抑制,Smo进入胞质,将信号下传,激活转录因子Gli,后者进入细胞核,启动Gli1, Wnt和EGF等目的基因的表达。SuFu通过结合Gli,阻止Gli激活下游靶基因,从而导致Hedgehog通路的抑制。研究发现Hedgehog信号通路在包括皮肤基底细胞癌、小细胞肺癌、成神经管细胞瘤、前列腺癌、胃癌、乳腺癌和胰腺癌等多种肿瘤组织中出现异常激活。有研究表明,Gli1通过上调MMP11参与了乳腺癌细胞的生长、侵袭和转移。另有研究表明,Hedgehog信号通路中Gli1通过调节ZEB2促进EMT发生、发展。EMT是否参与了食管癌的的发生、发展,并且MMP11、ZEB2是否参与其中均未可知；Hedgehog信号通路是否对食管癌有调控作用,具体调控途径如何亦未可知。本部分采用免疫组化的方法检测Gli1、MMP11、ZEB2在食管癌组织中的表达,并探讨其与临床因素的相关性。研究目的检测人食管鳞癌、癌旁组织和正常组织中Gli1、MMP11、ZEB2蛋白的表达水平,并探究它们和食管癌患者的年龄、性别、临床分期等临床病理因素的关系,为临床诊断食管鳞癌寻求新的思路。研究方法运用免疫组化的方法检测72例食管鳞癌组织及其对应的72例癌旁组织(距肿块边缘5cm以上)和18例正常的食管组织中Gli1、MMP11、ZEB2蛋白的表达水平。应用SPSS20.0统计软件比较Gli1、MMP11、ZEB2蛋白表达量与食管鳞癌组织、癌旁组织和正常组织的临床病理因素的关系。结果1、Gli1在食管鳞癌组织的阳性表达率为55.6%，癌旁组织为13.9%，食管正常组织中为11.1%,组间表达差异有统计学意义(P<0.05)。Gli1在癌旁组织和食管正常组织中的表达均显著低于鳞癌组织(P<0.05), Gli1在癌旁组织和食管正常组织中表达差异无统计学意义(P>0.05)。2、Gli1阳性表达率在Ⅰ期和Ⅱ期远低于Ⅲ期和Ⅳ期(P<0.05),T1期和T2期远低于T3期和T4期(P<0.05),无淋巴结转移的远低于转移的(P<0.05),但其表达与年龄、性别、肿瘤位置、直径及分化程度无关(P>0.05)。3、MMP11在食管鳞癌组织的阳性表达率为69.4%,癌旁组织为25.0%,食管正常组织中为22.2%,组间表达差异有统计学意义(P<0.05)。MMP11在癌旁组织和正常组织中的表达均低于鳞癌(P<0.05), MMP11在癌旁组织和食管正常组织中表达差异无统计学意义(P>0.05)。4、MMP11阳性表达率在Ⅰ期和Ⅱ期远低于Ⅲ期和Ⅳ期(P<0.05),T1期和T2期远低于T3期和T4期(P<0.05),无淋巴转移的远低于转移的(P<0.05),但其表达与年龄、性别、肿瘤位置、直径及分化程度无关(P>0.05)。5、ZEB2蛋白在食管鳞癌组织中的阳性表达率为60.5%,癌旁组织为14.0%,食管正常组织中为8.3%,组间表达差异有统计学意义(P<0.05)。ZEB2在食管癌旁组织和正常组织中的表达均显著低于食管鳞癌组织(P<0.05), ZEB2在癌旁组织和正常食管组织中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。6、ZEB2蛋白阳性表达率在Ⅰ期和Ⅱ期远低于Ⅲ期和Ⅳ期(P<0.05),T1期和T2期远低于T3期和T4期(P<0.05),无淋巴转移的远低于有淋巴结转移的(P<0.05),但其表达和患者的年龄、性别与肿瘤的位置、直径及分化程度无关(P>0.05)。7、Gli1、MMP11、ZEB2的表达在食管鳞癌中呈正相关。结论1、Gli1、MMP11、ZEB2与食管鳞癌的侵袭、转移相关,与患者的年龄、性别、肿瘤的位置、直径、分化程度无关。2、Gli1、MMP11、ZEB2参与了食管鳞癌的发生、发展过程,较高表达的Gli1、MMP11、ZEB2可能是促进食管鳞癌侵袭、转移的因素之一。3、联合检测Gli1、MMP11、ZEB2有助于判断食管鳞癌的恶性程度,可为临床诊断及治疗提供一定的理论参考依据。研究背景EMT的发生、发展与多种蛋白分子、基因及微环境等有关,涉及到多个相关信号转导通路的调控,其中包括P13K/AKT信号通路、TGF-β信号通路、Wnt信号通路和Notch信号通路等,并且受到多种生长因子的调节,如上皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子-β、成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子等,与上皮细胞表面的相应受体结合后,激活细胞内的信号通路,调节转导基因的表达,最终促进EMT的发生。环巴胺(Cyclopamine)是一种提取自山黎芦的甾体类生物碱,通过特异性地与Smo结合导致Hedgehog信号通路失活,使用环巴胺处理人肿瘤细胞系,或者用小鼠异种移植体培养的肿瘤活组织之后,在体内、外对多种肿瘤细胞的生长均有明显的抑制作用。本部分检测Hedgehog、EMT在食管癌细胞中的表达,采用环巴胺抑制Hedgehog后观察Hedgehog、EMT的变化,研究二者之间是否具有一定的相关性。研究目的检测人食管癌细胞及环巴胺干预后Gli1mRNA、MMP11mRNA、ZEB2mRNA的表达水平,探讨Hedgehog和EMT在食管癌细胞中的相关性,并验证环巴胺的治疗作用。研究方法1、MTT法检测环巴胺的时间-剂量-效应曲线及中效浓度。2.Real-time PCR检测人食管癌细胞EC9706加入环巴胺前后Gli1mRNA、 MMP11mRNA、ZEB2mRNA的表达水平。结果1、环巴胺处理EC9706后可以抑制细胞增殖、生长,细胞由饱满的梭形贴壁生长变为轮廓不清的圆钝半贴壁状态,在一定浓度下抑制率随浓度增高而增大且具有相关性,而且干预的时间越长,其抑制率也随之加大,在相当的范围内具有药物作用时间和作用浓度依赖性。作用2天后的IC5o为16±1.87μmol/L。2、环巴胺作用于EC9706后Gli1mRNA、MMP11mRNA、ZEB2mRNA表达均下调。结论1、环巴胺可以抑制人食管癌细胞EC9706的增殖。2、Hedgehog信号通路可能与MMP11、ZEB2具有一定的相关性,可能共同参与了食管癌细胞的增殖。3、环巴胺可能对食管癌具有治疗作用。