研究背景:随着肿瘤患者生存期得到延长,生活质量不断提高,多种肿瘤经过治疗逐渐以一种慢性病的模式长期存在。与此同时,研究显示心血管疾病领域为此付出了“惨痛代价”,肿瘤幸存者的心血管疾病死亡率高于肿瘤本身复发死亡率。肿瘤心脏病学作为一门新兴交叉学科,在心血管学科与肿瘤学科飞速发展的时代应运而生。目前中医药治疗肿瘤心脏病已被证实取得确切疗效,在防治肿瘤心脏病的持久战中发挥了一定积极作用。本团队发现化疗后所致心肌损伤属于中医核心病机“痰瘀毒虚,毒损心络”,前期基础研究发现西红花苷通过减少氧化应激,改善心肌线粒体功能起到保护心肌细胞的作用。鉴于氧化应激在心血管疾病中的作用,学界对西红花苷作为心肌保护剂的潜在作用表现出了相当大的兴趣,特别是蒽环类药物诱导的心脏毒性方面值得在临床试验中进一步研究。但是目前缺乏临床大规模试验的验证其疗效及安全性,不利于西红花苷的临床推广,因此设计本临床试验进一步临床验证西红花苷的疗效,挖掘遗传候选基因的多态性在化疗诱导心脏毒性诊疗中的治疗意义。研究目的和意义:1.设计一项临床试验,初步评价西红花苷对乳腺癌蒽环类化疗药物后心肌损伤心肌保护的中西医结合治疗的临床疗效与可行性,为综合性治疗肿瘤心脏病提供高质量的临床证据,填补心脏毒性预防药物的空白。2.基于信使核糖核酸（mRNA）测序分析西红花苷对蒽环类药物心脏毒性的作用,整合发掘西红苷调控的标志基因,构建关键蛋白互作模块与差异基因共表达网络,丰富靶点间的相互作用网络,并分析其核心生物过程与通路。3.设计全基因组关联研究以确定与蒽环类药物相关心肌损伤的单核苷酸多态性的表达,证实遗传候选基因的多态性在化疗诱导心脏毒性诊疗中的治疗意义,并提出可靠的化疗诱导心脏毒性的遗传预测因子。研究方法1.采用随机对照的试验方法,纳入150例接受蒽环类药物治疗的确诊为原发性乳腺癌患者,随机分为试验组和对照组。试验组患者接受西红花总苷片联合标准化疗方案治疗,第1天开始,予口服西红花总苷片一次4片,一日3次,连续服用6个月。对照组患者接受标准化疗方案治疗。所有患者治疗第6个月进行疗效评价。主要疗效指标为心脏毒性事件的发生率,次要疗效指标包括超声心动、心电图、脑钠肽,其他指标包括生活质量评价量表、中医证候积分量表并对不良反应事件及安全性指标进行监测。2.收集3例接受西红花总苷片联合蒽环类药物治疗的原发性乳腺癌患者和3例仅使用蒽环类药物治疗的乳腺癌患者的外周静脉血。使用R语言的DESeq包对两组提取的mRNA进行差异基因鉴定。针对全部差异mRNA构建蛋白质间互相作用的网络模块,并对上调mRNA和下调mRNA的通路进行富集和功能注释。使用rMATS软件对数据进行差异可变剪接分析。最后进行共表达分析,并采用Cytoscape软件构建共表达网络图,获得核心调控基因。3.收集100例接受蒽环类化疗药物治疗的原发性乳腺癌患者外周血血液样本。其中包括65例无心脏毒性患者和35例心脏毒性患者,构建接受蒽环类化疗药物治疗的原发性乳腺癌患者DNA数据库。通过DNA基因芯片进行测序确定潜在的具有预测意义的单核苷酸多态性（SNPs）。同时根据收集的临床信息,使用年龄作为协变量进行校正分析,使用R包和Plink完成关联性分析,筛选出具有显著性的SNPs,绘制曼哈顿图和QQ图。研究结果1.研究最终纳入132例患者,脱落18例患者。其中试验组和对照组各有66名患者。主要疗效指标为两组心脏毒性事件发生率,试验组为3.03%（2例）,对照组为15.15%（10例）,组间差异具有统计学意义（P=0.015）。试验组和对照组治疗后的左室射血分数（LVEF）分别为64.88±3.98%和63±3.25%,组间差异具有统计学意义（P=0.006）。试验组和对照组的LVEF较基线改变分别为-0.02±4.86%和1.09±4.86%,未显示统计学差异（P＞0.05）。对照组的治疗前后LVEF 比较具有统计学意义（P=0.004）,试验组则未见统计学差异（P＞0.05）。次要指标中包含超声心动、脑钠肽和心电图。其中,超声心动结果分LVEF、左室舒张末期内径（LVEDD）、左心房内径（LAD）、右心室内径（RVD）、E峰流速（E）、A峰流速（A）、E/A值,试验组和对照组的治疗后的组间比较和治疗前后的差值的组间比较均无统计学差异（P＞0.05）。对照组E值治疗前后分别为82.96±16.52cm/s和75.13±17.29cm/s。治疗前后的对照组组内比较具有显著的统计学差异（P=0.004）,试验组则未见统计学差异（P＞0.05）。研究期间两组脑钠肽数值保持稳定,组间比较及组内比较均无统计学差异（P＞0.05）。心电图结果分析了心率、QRS、QTc、P-R,试验组和对照组的治疗后的组间比较和治疗前后的差值的组间比较均无统计学差异（P＞0.05）。同时对心电图异常结果进行统计。结果显示,仅有对照组出现房室传导阻滞3例,但试验组的组间比较并无统计学差异（P=0.08）。这些患者分别为1例不完全性右束支传导阻滞、1例Ⅰ度房室阻滞和1例文氏传导阻滞。仅对照组有4例患者出现室性早搏,两组组间比较差异具有统计学意义（P=0.042）。试验组有10例患者出现了 ST-T段改变,对照组有21例,组间比较具有统计学差异（P=0.024）。这其中总计8例患者存在T波倒置和低平的情况,1例患者出现在试验组,7例患者出现在对照组,两组组间比较差异具有统计学意义（P=0.029）。治疗后有1例对照组患者评价NYHA分级时,被评估为Ⅱ级。蒽环类药物会引起多种心律失常和心肌缺血情况,试验组患者部分改善了这些异常情况。生活质量评价方面,使用FACT-B问卷作为生命质量评价的参考,试验组和对照组的治疗后的组间比较和治疗前后的差值的组间比较均无统计学差异（P＞0.05）。值得关注的是功能状况评分组内比较后发现,试验组和对照组治疗前后的组内差异具有统计学意义（P=0.019;P=0.01）,蒽环类化疗会显著影响患者的功能状况。此外,对照组的社会/家庭状况评分和共性模块总分组内比较同样具有显著性差异（P=0.013;P=0.04）,但试验组的组内比较却未发现显著性差异（P＞0.05）。采用卡氏评分来评估患者健康状态。研究期间两组组间比较及差值比较均无统计学差异（P＞0.05）。试验组治疗前后的卡氏评分分别为88.94±12.66分和92.12±6.45分,其差异有统计学意义（P=0.04）。试验组患者在健康和耐受化疗副作用方面得到了获益。试验组和对照组治疗前的中医证候积分分别为1.23±1.4分和1.17±1.21分,治疗后的中医证候积分分别为1.2±1.42分和1.21±1.21分,较基线改变为0.03±0.17分和-0.05±0.21分,两组差异具有统计学意义（P=0.026）。为进一步分析化疗所致心脏毒性特点,将患者参考主要终点事件划分为心脏毒性组和无心脏毒性组,总结具有心脏毒性患者中医证候分布特点,即有心脏毒性事件的患者以脘腹胀满、乏力、口干苦为主要特征,偶有面色晦暗、心悸、胸闷等症状表现;以气滞、气虚、痰凝、血瘀为主要证型特点。试验过程中所有入组患者均未发生严重的血常规及肝功能、肾功能指标异常的情况,未发生重度的药物相关不良反应,西红花总苷片的药物安全性良好。2.研究获得了 16个西红花苷调控肿瘤心脏病的标志基因,其中表达上调的有2个基因（XKR3、AL592183.1）,表达下调的有14个基因（DEFA3、MT-RNR1、SLC25A39、PPBP、C9orf78、TMCC2、PF4、IGHV3-23、NRGN、CLU、CA1、YBX1、FAM210B）。研究还分析了差异基因与蛋白质间的功能通路和互作关系,获得了相关的蛋白互作网络功能注释图和5组关键蛋白互作模块,其差异基因的功能通路发现主要与氧化应激、线粒体呼吸、解毒、细胞外基质受体相互作用等相关。研究还丰富了可变剪接分析事件和核心调控基因（EGF、ALAS2、PF4、THBS1、AHSP、GYPB、CLU、PPBP、PROS 1、SPARC）。3.研究纳入的原发性乳腺癌患者均为女性,蒽环类药物累积剂量平均为349±92mg/m2。基线期,心脏毒性组（AIC组）和对照组（Con组）的LVEF分别为67.54±5.13%和 64.29±3.49%,随访期两组LVEF 分别降至 57.88±4.5%和 63.31±4.29%,两组组间差异具有显著的统计学差异,P＜0.001;AIC组LVEF下降幅度较大,组内比较差异同样具有显著的统计学差异,P＜0.001。基线期,AIC组和Con组的LVEDD分别为43.34±4.15mm和43.92±3.22mm,随访期两组LVEDD分别扩大至44.03±4.85mm和43.96±3.16mm,两组组间差异具有显著的统计学差异,P＜0.001;此外,AIC组和Con组LVEDD均有增加,两组组内比较差异同样具有显著的统计学差异,P＜0.05。分析质量测定合格的99例样本,最终发现81个SNP位点呈现全基因组水平的相关性,其中P＜10-4的SNPs位点是rs11619798突变基因（P=9.82E-5,95%置信区间[0.09623,0.4613]）。GO富集分析结果显示这些基因与细胞粘附、免疫细胞激活、细胞骨架、免疫球蛋白生产、MHC-II类蛋白复合物等相关功能相关。研究结论1.临床研究显示,西红花苷联合蒽环类化疗药物治疗原发性乳腺癌6个月后,在不影响肿瘤疗效的情况下,有效降低心脏毒性事件发生率,改善患者生活质量及部分临床症状。2.西红花苷调控基因涉及多种生物功能、多条信号通路,其差异基因的调控通路可能与氧化应激、线粒体呼吸、解毒、细胞外基质受体相关。3.全基因组关联分析结果证实了基因的多态性在蒽环类药物诱导的心脏毒性诊疗中的治疗意义,这些结果将有助于肿瘤心脏病早期筛查和个体化预防。