局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)为儿童和成人肾病综合征的常见病理类型。FSGS病理上以足细胞病变为特征;临床上表现为大量蛋白尿,容易出现急性肾损伤、静脉血栓栓塞等并发症。部分患者激素治疗效果不理想,进展为终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)。其发病机制尚未完全阐明,尤其是循环因子在FSGS发病中的研究结果更是莫衷一是。近年来有关循环miRNAs的研究则表明循环miRNAs不仅可以作为多种病理生理过程的生物标志物,而且可以随血液循环到达远隔部位从而介导细胞之间的相互交流。因此,本研究首先从活动性FSGS患者循环中寻找出疾病活动相关的miRNAs,然后探讨这些miRNAs在FSGS发病过程中的作用,以加深对FSGS发病机制的认识。研究一:循环miRNAs与局灶节段性肾小球硬化患者疾病活动的关系目的:分析循环中与FSGS患者疾病活动相关的miRNAs,为后续探讨循环miRNAs在FSGS发病中的作用奠定基础。方法:选取年龄、性别匹配的活动性FSGS患者及正常对照血浆各9例,提取血浆总RNA,采用TaqMan低密度芯片(TaqMan Low Density Array)进行miRNA表达谱分析,筛选出在活动性FSGS患者循环中表达上调的miRNAs分子。然后再选取32例活动性FSGS患者血浆,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)方法对筛选出的miRNAs分子进行验证。同时与非活动性FSGS患者进行比较。采用ROC曲线分析循环miRNAs区分活动性FSGS与非活动性FSGS和正常对照的效能。结果:与正常对照相比,活动性FSGS患者循环miR-125b,miR-186和miR-193a-3p水平显著上调(P<0.05)。ROC曲线分析显示,循环miR-125b,miR-186和miR-193a-3p区分活动性FSGS与正常对照的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.882、0.789和0.910。与非活动性FSGS相比,活动性FSGS患者循环中miR-125b和miR-186水平也明显上调。结论:活动性FSGS患者循环miR-125b,miR-186及miR-193a-3p较正常对照显著升高,其中miR-186的升高与疾病的活动性关系更密切。研究二:局灶节段性肾小球硬化患者T细胞分泌的miRNAs对足细胞的作用研究目的:T细胞功能异常及足细胞损伤是FSGS发病的关键环节。而近年研究则表明分泌型miRNAs可以介导细胞与细胞之间的相互交流。本研究的目的是探讨FSGS患者T细胞分泌的miRNAs的特点及其对足细胞损伤的机制,以加深对FSGS发病机制的认识。方法:采用免疫磁珠法分离FSGS外周血T细胞,并进行体外培养,收集其分泌的MV。采用qRT-PCR方法检测FSGS患者T细胞及其分泌的MV中miRNAs的表达水平。然后采用体外及体内实验研究这些miRNAs引起足细胞损伤的机制。以Jurkat细胞为供体细胞,足细胞为受体细胞。收集Jurkat细胞分泌的MV,检测其中miRNAs表达水平。然后将Jurkat细胞分泌的MV与足细胞孵育后检测足细胞中CD2AP表达。并将Jurkat细胞分泌的MV通过尾静脉注射的方式注射Balb/c小鼠,检测尿蛋白变化及肾组织病理改变。结果:FSGS患者T细胞中miR-186表达量高,但与正常对照相比无明显变化。而miR-125b及miR-193a-3p在正常及FSGS患者T细胞中表达量均极低。FSGS患者CD3+T细胞分泌的MV中miR-186含量较正常对照明显升高(P<0.05)。Jurkat细胞分泌的miRNAs能进入足细胞,并下调足细胞中CD2AP表达;在体内可以引起小鼠蛋白尿出现及足细胞足突融合。结论:FSGS患者T细胞分泌的miR-186与正常对照存在显著差异。T细胞分泌的miR-186能引起足细胞CD2AP表达下调及足细胞足突融合,并引起蛋白尿。这一结果提示T细胞分泌的miRNAs可能参与FSGS发病。