研究背景:结核病是一种发病率较高、传染性较强的呼吸道传播类疾病,是由结核分枝杆菌感染人体各个器官引起的,当其侵入肺部时成为肺结核。耐药结核病是由耐药性结核分枝杆菌引起的疾病,这种结核杆菌感染机体后,对治疗结核类药物如异烟肼（Isoniazid,INH）、利福平（Rifampicin,RIF）、链霉素（Streptomycin,SM）、乙胺丁醇（Ethambutol,EMB）等产生耐药性。不规范、错误使用药物,或使用不正规的劣质药物都可能引起耐药菌的出现。研究发现,利福平、异烟肼、链霉素等药物作用位点的基因突变与结核分枝杆菌耐药性的产生密切相关,因此早期开展耐药基因检测对于指导临床个体化精准用药和提高治愈率至关重要。传统的耐药性结核病的检测需要涂片、培养、药敏鉴定等,耗时较长。近年来,恒温扩增技术如滚环扩增（Rolling Circle Amplification,RCA）、链置换扩增（Strand Displacement Amplification,SDA）等不断发展,该类方法操作简单、不需要特殊仪器、检测灵敏度高、多重分析能力强。其中,RCA是在恒温下对环状的DNA模板进行循环扩增得到长链核酸的过程,可避免传统扩增循环过程对实验设备要求。RCA扩增模板为锁式探针（Padlock Probes,PLPs）,其环化时所需的连接酶在恒温条件下反应时能较为敏感地识别单碱基突变。RCA在单条引物参与时的恒温条件下可短时间内扩增出大量与环状模板互补的串联重复核苷酸长链。而目标靶序列仅参与PLP环化模板的形成,可避免扩增反应带来的潜在污染。分子诊断的发展需要创新型工具来同时量化复杂介质中的多个生物靶点,因此,本研究提出了基于滚环扩增和多色荧光的传感技术用于结核分枝杆菌耐药基因多重检测的策略。通常情况下,核酸扩增产物采用凝胶电泳法检测,然而,这种技术耗时,也无法产生可量化的数据。目前,基于吸光度、表面增强拉曼光谱（Surface-enhanced Raman Spectroscopy,SERS）和荧光光谱等研究的光学生物传感平台受到了广泛地关注。所以,在RCA结束时引入相应的荧光探针,对扩增产物特异性地进行识别捕获后,通过对反应体系中相对荧光强度的实时监测和测量,即可实现对体系中的多种耐药突变基因的快速、简便、高灵敏及多重耐药检测。利用这种原理,我们构建了基于等温扩增的、灵敏的、具有选择性的多重检测平台,并将其运用于结核杆菌耐药相关基因突变位点的检测。由于荧光检测方法自身的技术缺陷,对较低浓度的目标物进行检测时,背景信号的吸收容易造成假阳性结果,且检测所需样本体积量大。所以,要实现更便捷和更高灵敏度的检测,需要寻找其他技术。目前,表面增强拉曼光谱（SERS）由于其灵敏度高、检查样品体积小和具有特异的信号等优点已被广泛运用于多种生物分子的检测。拉曼光谱检测范围在200 cm^-1至4000 cm^-1,可表征光子与分子相互作用产生的分子振动和转动能级差,不同物质拉曼位移不同。SERS技术将待测分子吸附于粗糙的纳米金属材料表面以增强待测物的拉曼散射强度。包括无标记检测和标记染料检测两种方法。将RCA技术与SERS检测方法相结合,可进一步增强拉曼信号。因此,本研究又联合了滚环扩增与表面增强拉曼光谱技术,构建了基于RCA的SERS检测方法,用于结核分枝杆菌耐药位点的精准定量分析。研究目的与意义:本研究旨在构建基于核酸等温扩增的简单快速、超灵敏的生物传感平台,并将其运用于结核杆菌耐药相关基因的多重检测。恒温型扩增方法改变了普通检测方法对PCR的依赖,为耐药结核的临床快速诊断提供了新方法,从而避免抗结核类抗生素早期的滥用。进一步使得基于RCA的荧光和SERS传感技术成为基因疾病早期诊断的有效方法,也为耐药基因突变位点的单管多重检测研究提供了全新的研究思路与发展前景。方法:1.对Genbank中检索到的结核分枝杆菌标准菌株全基因组（Mycobacterium Tuberculosis H37Rv,Gen Bank Accession No:NC＿000962）进行同源性比较和特异性分析,筛选高频突变的耐药位点及耐药决定区域序列。2.根据突变靶点的位置设计包含磷酸基团、引物结合区、酶切位点作用区的锁式探针PLP,引物和捕获探针。3.利用生物素和链霉亲和素的共价偶联作用,以磁珠作为扩增载体构建固相反应体系。分别探讨BSA浓度、d NTP浓度、DMSO浓度、Phi 29 DNA polymerase浓度、扩增温度、扩增时间和野生型模板与突变型模板浓度比（靶序列的突变率）对扩增体系的影响,确定最佳反应条件。4.筛选用于多重检测的荧光基团并将其修饰到检测探针上,将该类探针与RCA产物结合,使用对应的荧光激发和发射波长来检测杂交产物,观察信号响应结果。5.合成纳米材料,包括金银纳米核壳（Au NR@Ag）复合材料、金纳米颗粒（Au NPs）和银纳米颗粒（Ag NPs）。并对3种纳米材料及其与DNA结合前后的物质进行表征,包括紫外-可见光（UV-Vis）、透射电镜（TEM）、粒径分析。6.利用拉曼标签分子对3种SERS增强纳米材料进行综合评价,包括最适激发光波长、增强效果等,验证不同纳米材料检测DNA的SERS效应,筛选最适的增强纳米颗粒。7.构建基于RCA的SERS检测方法,并对其检测性能进行评价,包括特异性、灵敏度、稳定性等。研究结果:1.确定了3种临床常用的抗结核药物的耐药基因及其主要突变位点:对异烟肼耐药的Kat G315突变位点,对利福平耐药的rpo B531突变位点,对链霉素耐药的rps L43突变位点。通过对临床标本中分离的利福平、异烟肼、链霉素耐药的结核菌的耐药特征进行分析,提取DNA后进行PCR扩增,得到耐药相关基因rpo B基因、kat G基因和rps L基因的主要耐药决定区域,并通过T-A克隆构建了相关质粒。2.根据各突变位点设计RCA反应所需要的模板、锁式探针（PLP）、引物（Primer）。了解了PLP识别探针的设计原则、引物的设计位置和检测探针的设计方法。3.根据生物配体的共价偶联作用,完成了生物素引物与链霉亲和素修饰磁珠的交联,利用磁珠颗粒形成了固相反应体系。构建了在液相环境下合成环状PLP模板,在固相（磁珠）表面进行扩增反应的RCA体系,并对RCA体系的反应条件进行了优化。其最适反应条件为温度37℃、BSA 0.1μg/μL,DMSO 5%,Phi 29DNA聚合酶1 U/μL,d NTP 1 m M,反应时间15 min。4.建立了基于RCA的荧光检测方法,筛选Cy5、Cy3、ROX作为特征染料来修饰检测探针。扩增产物与检测探针混合后,带有荧光的探针可与RCA产物上每一个重复序列上的一小段检测序列杂交。因此,在相应激发波（643 nm、552 nm、585 nm）和发射波（667 nm、570 nm、605 nm）的激发作用下,产物会有对应的特征信号响应。例如,当3种靶序列同时存在时,Cy5、Cy3和ROX的荧光信号均可被扫描到。以此来鉴定扩增体系是否发生单碱基突变或发生了何种突变,继而进行耐药性分析。5.将构建的基于RCA的荧光检测平台运用于结核杆菌耐药相关基因,可对发生单碱基突变的结核杆菌单独检测,也可以直接在2-3 h内同时检测10^-12M水平的3种耐药突变型结核分枝杆菌靶序列。6.成功将DNA与3种纳米粒子（Au NPs,Ag NPs,Au NR@Ag）偶联起来,并进行UV-Vis、TEM、和粒径分析的表征,完成了SERS纳米标签探针的构建。7.利用拉曼标签分子Cy5对3种SERS增强纳米材料进行评价。最终确定了Au NR@Ag为最合适的SERS增强纳米材料,最适检测激光为785 nm。并选取1408cm^-1处的特征峰来做进一步的实验。8.成功构建了基于RCA的SERS检测平台,并对Kat G315基因进行了检测。发现该方法对单碱基突变具有检测特异性,并可以检测到浓度为10^-14M的目标物。研究结论:1.本研究设计特殊的PLP探针来识别不同的结核分枝杆菌耐药突变位点,以成环后的该探针作为模板进行滚环扩增可得到许多相同序列串联在一起的长链核酸产物。2.构建的基于滚环扩增的恒温扩增体系结合光学传感技术,建立一种核酸检测方法,从基因层面更加深入地分析不同耐药突变型目标物,为在临床实际的检测工作提供研究基础。3.构建的基于RCA的荧光检测平台可在短时间内对3种临床常见的结核耐药突变基因进行特异性多重检测。4.构建的基于RCA的SERS传感检测平台可进一步提高检测的灵敏度。