猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2, PCV2)是仔猪多系统衰竭综合症(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原。目前的研究已经鉴定了该病毒的三个编码蛋白,即ORF1编码的与复制相关的Rep蛋白,ORF2编码的衣壳蛋白Cap,以及ORF3编码的凋亡相关蛋白ORF3蛋白。本研究鉴定了猪圆环病毒2型ORF4编码蛋白,并分析了猪圆环病毒2感染后宿主免疫器官的基因表达谱,旨在探讨PCV2编码蛋白在致病中的作用及其宿主的反应性。1.PCV2ORF4蛋白转录与蛋白水平的验证本研究利用表位预测软件BepiPred1.0Server分析出的PCV2潜在的ORF4抗原表位,借助化学合成法合成了含PCV2-ORF4的表位多肽,以合成的表位多肽和真核表达质粒pCI-ORF4为抗原免疫BALB/c小鼠制备了抗PCV2-ORF4编码蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体。利用制备的ORF4单克隆抗体和和多克隆抗体可在PCV2感染及ORF4基因转染的PK15细胞中检测到特异性的信号,但不能在正常PK15细胞和ORF1、2、3基因转染的细胞检测到任何信号,说明在PCV2感染细胞中独立于ORF1、ORF2和ORF3外存在基因编码的新的病毒蛋白ORF4。 Northern blot的结果显示,ORF4相应的转录本约为180bp,利用了与ORF3不同的起始密码子,其转录本完全叠加在ORF3内,转录方向与ORF3相同。上述结果分别从蛋白和转录本水平验证了PCV2ORF4基因的转录和表达,为后续该蛋白的功能研究提供了依据。2. ORF4蛋白体内外功能研究为了分析PCV2-ORF4编码蛋白的功能,本研究构建了缺失ORF4蛋白的感染性克隆(PCV2△),并以PK15细胞为载体拯救出缺失体病毒PCV2△,经复制动力学分析提示ORF4蛋白是PCV2复制的非必需蛋白。利用拯救的PCV2△和野生型病毒(wPCV2)分别感染细胞和小鼠分析ORF4蛋白的功能。结果显示,PCV2△感染细胞后能够引起caspase-3、8、9(?)活性的提高,提示ORF4与凋亡抑制相关。在PCV2△感染小鼠体内,与野生型病毒比较,PCV2△感染鼠的血清病毒载量提高约20～100倍，并展示早期较为严重的淋巴组织损伤。与此同时在PCV2△体内出现了严重的CD3+CD4—+、CD3+CD8+、CD4+CD8+T淋巴细胞减少,说明ORF4蛋白缺失的PCV2在小鼠体内比野生型PCV2具有更强的致病力,揭示ORF4基因是PCV2致病的负调控基因。3.猪圆环病毒2感染后的宿主免疫组织基因表达谱分析为了分析PCV2感染后免疫器官的反应性,我们使用基因芯片技术在转录组学水平分析了PCV2感染猪淋巴结和小鼠脾脏的基因表达谱。结果显示,在PCV2感染猪的腹股沟淋巴结中发现66个差异转录本,主要包括：44个涉及大分子代谢(20%)、分化及发育(18%)、转运(13%)及细胞骨架(7%)相关上调转录本,22个涉及免疫及炎症反应(57%)、代谢(9%)的下调转录本。在PCV2感染的小鼠脾脏发现137个差异转录本,包括：40个影响代谢(12%)、分化及发育(12%)、免疫(]0%)、信号转导(10%)、大分子生物合成相关(10%)的上调转录本,73个影响代谢(13%)、分化及发育(15%)、免疫反应(12%)大分子生物合成(11%)及信号转导相关(11%)的下调转录本。应用荧光定量PCR方法对基因芯片所获得的20个猪差异转录本和29个小鼠差异转录本信息进行了验证,结果显示,除小鼠的下调转录本的变化趋势差异较大外,其他转录本的芯片结果与荧光定量PCR的结果基本完全相符。western-blot分析显示,解聚因子cofilin1和DSTN的非磷酸化活性形式的蛋白水平在感染后发生了上调,与芯片中的转录本水平变化一致,提示PCV2的感染可能通过解聚因子的上调诱导宿主发生肌动蛋白解聚。