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背景肝纤维化是各种慢性肝病发展为肝硬化的必经环节,但肝纤维化的发病机制目前仍不十分清楚。近年来有报道提出肥大细胞(mast cell, MC)直接或间接参与了其他纤维化疾病的病理过程,但其具体机制复杂,至今尚未完全明了。推测肥大细胞分泌类胰蛋白酶等调节因子,通过后者激活靶细胞膜上的蛋白酶激活受体-2(protease activated receptor-2, PAR-2)来促进其胶原合成。鉴于MC参与肝纤维化过程,推测PAR-2亦在肝纤维化中发挥重要作用,但未得到进一步证实。目的观察肝纤维化大鼠模型中PAR-2的表达及其与肝纤维化的关系。方法1.建立大鼠肝纤维化模型:模型组给予40%CCl4花生油溶液2.5ml/kg皮下注射,每周2次,连续12周。对照组给予等量的生理盐水。分别于造模2、4、8、12周处死大鼠。2.对肝组织进行常规HE染色及Masson胶原染色评价大鼠肝纤维化程度。3.甲苯胺蓝染色法对肝组织中肥大细胞进行染色与计数。4.肝组织中羟脯氨酸含量的测定:采用羟脯氨酸碱水解法测试盒(南京建成生物工程研究所)。5.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测正常对照组及造模2、4、8、12周大鼠肝组织中PAR-2mRNA的表达。所用试剂、器材为:逆转录试剂盒(美国promega公司),JS-380自动凝胶图象分析仪(武汉协和医院胃肠病实验室)。6.免疫组化方法检测PAR-2蛋白的表达及定位。所用试剂为:羊抗PAR-2多克隆抗体(美国Santa Cruz公司),SP免疫组化试剂盒(北京中山公司),DAB显色试剂盒(华美生物工程公司)。结果1.随着造模时间的延长,肝脏纤维化程度逐渐加重。正常肝组织中纤维面积不足1%,而模型组2、4、8、12周纤维组织面积分别约5%、11%、16%、25%。2.正常对照组大鼠肝组织中MC数量很少(2.533±0.952),主要沿肝脏汇管区分布;模型组:2周后,MC数量增加(造模2周vs.正常对照组, 9.080±0.540 vs. 2.533±0.952,P<0.05),4周后显著增加(造模4周vs.造模2周,15.667±2.906 vs. 9.080±0.540,P<0.05),8周后数量进一步增加(造模8周vs.造模4周,32.040±3.278 vs. 15.667±2.906,P<0.05);多见汇管区、中央静脉周围MC密集分布。初期MC多分布于汇管区,在肝纤维化后期还可沿纤维间隔分布。纤维化8周后,可见MC胞体增大,出现较多脱颗粒现象。3.随着造模时间的延长,肝脏羟脯氨酸的含量逐渐升高。4.正常对照组中几乎检测不到PAR-2mRNA的表达;造模2周肝组织可有少量PAR-2mRNA表达(PAR-2/β-actin造模2周vs.正常对照组,0.148±0.013 vs.0,P<0.05),4周表达增加(PAR-2/β-actin造模4周vs.造模2周,0.351±0.021 vs. 0.148±0.013,P<0.05),8周后维持在较高水平(PAR-2/β-actin造模8周vs.造模4周,0.803±0.016 vs. 0.351±0.021,P<0.05)。5.正常对照组中PAR-2蛋白表达少(阳性信号灰度156.035±0.514);造模2周肝组织可见少量PAR-2蛋白的表达(阳性信号灰度造模2周vs.正常对照组,162.464±1.280 vs. 156.035±0.514,P<0.05),4周表达增加(阳性信号灰度造模4周vs.造模2周,174.751±1.257 vs. 162.464±1.280,P<0.05),8周后维持在较高水平(阳性信号灰度造模8周vs.造模4周,185.654±2.102 vs. 174.751±1.257,P<0.05)。PAR-2主要在肝星状细胞、血管内皮细胞、汇管区成纤维细胞等部位表达。结论1.肥大细胞参与肝纤维化的发生发展过程。2. PAR-2 mRNA及蛋白的表达水平与肝纤维组织面积、肥大细胞数量、羟脯氨酸含量的增加相一致,提示PAR-2的激活与肝纤维化有关。