本课题的前期研究已总结出体外从外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell；PBMC)诱导分化DC的成熟技术。本研究通过克隆bcr/abl基因，连接表达缺陷的逆转录病毒，构建bcr/abl重组表达载体，逆转录病毒介导bcr/abl融合基因转染脐血干细胞来源DC，构建Bcr/abl特异性DC瘤苗，为进一步的DC瘤苗抗CML研究打下基础。 材料与方法:一.bcr/abl融合基因逆转录病毒载体的构建1.引物设计根据pGD210全长bcr/abl融合基因序列设计1对引物用于扩增诱导特异CTL所需bcr/abl融合位点两侧的基因序列。 2.bcr/abl基因片段的合成1)K562细胞株的培养：用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液于37℃、5％CO2培养箱内常规培养，隔天换液。 2)从K562细胞提取总RNA：收集5×106个K562细胞，Trizol法从K562细胞提取总RNA，电泳检测并核酸蛋白分析仪测O.D值定量RNA浓度。 3)RT-PCR扩增bcr/abl片段：逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，用bcr/abl特异引物进行PCR扩增得到含BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切位点的490bp大小的bcr/abl片段，电泳检测并核酸蛋白分析仪测O.D值、浓度。 3.提取载体pLXSN质粒于琼脂平板上挑取单菌落(已转化pLXSN缺陷型逆转录病毒载体)，接种至10mlLA培养基中，37℃剧烈震摇过夜后提取pLXSN质粒DNA。电泳检测并核酸蛋白分析仪测O.D值、浓度。 4.pLXSN-bcr/abl重组体的构建1)按PCR纯化试剂盒操作说明纯化PCR产物。 2)将纯化的PCR产物与pLXSNDNA分别经EcoRⅠ和BamHⅠ常规方法双酶切，按凝胶回收试剂盒操作说明分别回收bcr/abl、pLXSNDNA双酶切产物。 3)在T4DNA连接酶的作用下将bcr/ablDNA与pLXSN酶切、凝胶回收产物于16℃过夜连接。 4)Cacl2法制备DH5a感受态细菌，将连接产物转化感受态菌株。氨苄青霉素抗性筛选后，得到的阳性克隆菌株。 二.pLXSN-bcr/abl重组体的鉴定1.挑取单克隆转化子，提取质粒DNA，双酶切后凝胶电泳鉴定。2.将双酶切后凝胶电泳得大小相符两条带的转化子行bcr/abl序列测定。3.中量提取验证后的plxsn-bcr/abl重组体质粒，乙醇沉淀法浓缩质粒DNA。 三.plxsn-bcr/abl的包装1.EcoPack2TM-293细胞株的培养：用含10％优质胎牛血清(fetalcalfserum；FCS)的高糖D-MEM培养液于37℃，5％CO2培养箱内常规培养，隔天换液。 2.质脂体转染法将pLXSN-bcr/abl重组体转染入EcoPack2TM-293细胞，48小时收集病毒上清液，浓缩病毒上清。 3.同时以相同条件、体系转染一孔绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein；GFP)质粒，48小时荧光倒置显微镜下观察GFP表达情况。 4.用G418筛选重组体转化后EcoPack2TM-293包装细胞，冻存阳性克隆EcoPack2TM-293产病毒细胞株。 四、包装病毒的鉴定、滴度测定1.鉴定病毒基因组中是否含有bcr/abl基因片段Trizol法提取浓缩后的病毒总RNA，进行RT-PCR扩增，产物电泳鉴定。同时收集未经转化pLXSN-bcr/abl重组体EcoPack2TM-293上清作为对照组，相同方法浓缩、提取RNA、RT-PCR、电泳。 2.测定病毒滴度测定前一天6孔板种植NIH3T3细胞。感染当天，移去培养液，加入无血清培养液1mL(分别含有10、102、103、104、105、106稀释的100倍浓缩病毒液)，多聚季胺盐(polybrene)终浓度8μg/mL。37℃，5％的CO2中培养3小时后，于每孔加人3ml完全培养基。继续培养48小时，每孔接种于含有600μg/ml的G418的75cm2的培养瓶中进行筛选，每3天换液一次，直单克隆形成。于倒置显微镜下计数最高稀释度的克隆数。病毒滴度(cfu)=克隆数×稀释度×10。 五.构建bcr/abl特异性树突状细胞瘤苗1.DC的体外培养采新鲜脐血40mL，生理盐水2：1稀释，Ficoll法分离脐血MNC，用含10％人血清(humanserum；HS)合成培养液(IMDM及RPMI-1640)重悬细胞，37℃，5％CO2静置2小时后收集悬浮细胞加入25cm2培养瓶中，加入细胞子：rhSCF、FL，rhGM-CSF，TNF-α，培养箱内，第4天传代。第7天停rhSCF、FL，加细胞因子：rhGMCSF，TNF-α，IL-4。隔日半量更换培养液和细胞因子。每日倒置显微镜下观察细胞。 2.流式细胞仪(flowcytometer；FCM)检测DC表面标记培养第14天，收集病毒转染组DC，FITC鼠抗人单抗：CD1a、CD14、CD83标记，FCM检测分析。 3.重组逆转录病毒感染树突状细胞构建瘤苗分别在DC培养的第3、4、5天，加入用浓缩后新鲜培养液重悬的重组病毒。加入病毒后，室温，1000r/min离心1h后置33℃，5％CO2培养箱内培养4～6h后转置37℃，5％CO2培养箱继续培养。 收获重组逆转录病毒成功感染的树突状细胞为特异性bcr/abl树突状细胞瘤苗。 4.重组逆转录病毒感染DC的鉴定分别提取经病毒转染和未经病毒转染的DC的DNA，PCR扩增产物1％琼脂糖凝胶电泳分析。 结果:一.扩增bcr/abl融合基因片段及提取pLXSN质粒1.提取K562细胞总RNA，测得浓度为260ng/ul，OD260/280为1.73，琼脂糖凝胶电泳见18S、28S条带。RT-PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳见约500bp条带。测得产物浓度为120ng/μl。 2.提取pLXSN质粒，经电泳见质粒为6.0kb，测得浓度为36ng/μl，OD260/280为1.70。 二.pLXSN-bcr/abl重组体的构建、鉴定1.连接产物转化DH5a感受态细菌，LA培养皿过夜培养可见10余转化子。挑取其中10个单克隆提取质粒，EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后琼脂糖凝胶电泳，其中6个克隆可见约500bp和6.0kb两条带。 2.以经双酶切验证的重组体为模板，PCR扩增产物糖凝胶电泳得到约500bp的条带，序列测定结果与已知bcr/abl融合基因的序列相同。 3.提取pLXSN-bcr/abl重组体质粒，测得浓度为40ng/ul，OD260/280为1.70。乙醇沉淀法得浓缩质粒1ug/ul。 三.脂质体法转化pLXSN-bcr/abl重组体1.通过脂质体法转化EcoPack2TM-293细胞，48小时收集病毒。2.GFPDNA转化孔，48小时荧光倒置显微镜下观测绿色荧光表达约80％。 四.包装病毒的鉴定、滴度测定 3.提取浓缩病毒总RNA，RT-PCR产物电泳可见约500bp条带，对照组未见该条带。 4.测得100倍浓缩病毒上清病毒滴度为6×105cfu/mL。 五.重组逆转录病毒介导bcr/abl转染树突状细胞1.加入细胞因子培养48小时后可见细胞克隆生长，以后克隆逐渐增大、增多，细胞体积逐渐增大。病毒转染的DC组在培养第9天左右可见部分细胞死亡，细胞数相比未经病毒转染组细胞明显减少，细胞形态无明显差异。第11天可见松散半悬浮细胞簇，胞浆有毛刺样突起。第13天可见毛刺状突起的DC。培养瓶底可见拉长梭形巨噬细胞和细胞碎片。 2.第14d收集的病毒转染组DC，FCM检测细胞表面标记结果：CD14：6.74％，CD1α：12.94％，CD83：23.39％。 3.重组逆转录病毒转染DC的鉴定分别提取转染组和未转染组DC的DNA，PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳，转染组可见一条约500bp条带，而未经病毒转染组未见该条带。 结论:1.克隆bcr/abl融合基因片段，成功构建pLXSN-bcr/abl表达载体。 2.脐血单个核细胞经SCF、LF、GM-CSF、TNF-α、IL-4联合培养后，可诱导分化成形态典型、功能成熟的DC。 3.阳离子脂质体介导pLXSN-bcr/abl重组体转化EcoPack2TM-293包装细胞效率较高，能产生较高滴度的活性良好的缺陷型逆转录病毒。 4.逆转录病毒介导bcr/abl融合基因成功转染脐血来源DC，成功构建bcr/abl特异性树突状细胞瘤苗。