研究背景与目的：　　系统性红斑狼疮是一种自身免疫介导的损伤多系统器官的弥漫结缔组织疾病，狼疮性肾炎(lupus nephritis, LN)是 SLE最多见、最严重的脏器损伤。肾脏病理显示几乎所有SLE均有轻重不同的肾脏损伤。当今LN的疗法多用糖皮质激素及免疫抑制剂等药物来减慢疾病的进一步发展。这些药物具有副作用较大、停药后易复发等不足。尽管在过去的二十年里，在治疗 LN的各个领域都取得了巨大进步，但仍有20%的LN患者在10年内进展至终末期肾病。因此，除了探索更有效而毒副作用更低的药物来治疗LN外，寻找能够早期监测LN活动的生物标记，从而减少肾损伤和免疫抑制剂的使用，也是LN的研究热点。　　中医药对于LN的治疗具有独到的认识，积累了丰富的经验。中医认为LN是由于正气不足，气血阴阳失调，热毒邪气乘虚而入，燔灼营阴，内侵及肾，阴精受损，瘀阻血脉肾络所致。本病的病机特点是以阴阳失调为本，热毒瘀结为标。研究证实，热毒血瘀证是LN最常见的证型之一，可达39.81%，多属于LN的急性活动期。临床上，采用清热活血法治疗LN，对于巩固疗效、减轻免疫抑制剂副作用等方面具有独特的优势。但是由于本病的辨证分型主要靠医生的主观判断，缺乏广泛认可的规范，辨证分型是中医诊疗的关键所在，辨“证”的准确性至关重要。因此，LN热毒血瘀证诊断的规范化是亟待解决的问题。LN中医证候的物质基础研究以前多从免疫、生化和病理等方面探索并取得一些成果，但与从整体的层面阐明其机制还有距离。　　蛋白质组学的理论及技术的不断发展是中医证候客观化研究的全新突破口，蛋白质组学多元化综合分析细胞、组织或机体的所有蛋白的表达和功能。它不同于采用一个或几个指标研究疾病的病理生理，而是具有整体性和动态性，能够更准确地反映机体的状态。中医证候是人体疾病发生发展过程中某一时刻或阶段的综合反应并随病程发展发生相应变化，包含病因、病位、病性和邪正关系，代表的是一种功能状态。据此蛋白质组学与中医学证候的整体观、即时性和辨证论治思维相吻合，与中医认识和解释疾病的方法相一致。而这些特点决定了利用蛋白质组学技术研究 LN中医证侯的可行性，中医证候诊断标准的探索和规范可加深对证的理解与对证的把握，是中医学与生命科学交汇的关键。　　LN血清中各种抗体与肾系膜细胞膜上抗原结合形成的免疫复合物在LN的病程中发挥了重要作用。因此，在体外模拟体内免疫复合物刺激肾系膜细胞，对于进一步探讨LN的发病机制和中医证候的分子基础具有重要意义。而目前关于LN热毒血瘀证型的细胞蛋白质组学尚无研究报道。因此，我们用热毒血瘀型LN患者、非热毒血瘀型LN患者与正常人的血清刺激人肾系膜细胞，再用基于DIGE-基质辅助激光解吸离子化-飞行时间/飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF-生物信息学）的差异蛋白质组学技术平台获得LN热毒血瘀证差异表达的蛋白质。从分子水平探寻LN热毒血瘀证“病-证”对应的物质基础以及潜在的药物靶点治疗，为LN辨证论治提供新的认知视角，进一步为中医药的现代化研究奠定基础。　　研究方法：　　1.人肾小球系膜细胞培养　　人肾小球系膜细胞(HGMC)购自美国ATCC库。细胞复苏后在37℃、5%CO2培养箱中，用含10%FBS的DMEM培养基培养，待细胞长至70%-80%时，改用无血清培养基静置24小时后备用，本研究采用6-10代细胞进行实验。　　2.人血清标本采集制备　　按照纳入标准和排除标准选取 LN热毒血瘀证患者、LN非热毒血瘀证患者(各5例)；并选择同期来自体检中心的健康人5例。采集3组研究对象的血液，离心15min，3000rpm。取上清用0.2μm滤器过滤后分装保存备用。　　3.人血清刺激肾系膜细胞　　将人系膜细胞同步化24h后，分别加入正常人、LN患者血清，刺激24h后收集上清，用2-D Clean-up Kit试剂盒除去上清中干扰双向电泳的物质（盐、脂肪、多糖等）。再以2D Quant Kit蛋白质定量试剂盒测定总蛋白浓度。　　4.蛋白质荧光染料标记　　每组取25μg蛋白质混匀作为内标，用400 pmol Cy2标记50μg内标蛋白，再依次以50μg蛋白每400 pmol Cy3和400 pmol Cy5标记，冰上避光放置30 min，再加1μl亮氨酸(10 mmol/L)中止反应10 min。　　5.蛋白质的双向凝胶电泳　　50μgCy2，Cy3和 Cy5标记的样品进行混合，上样，30V水化13h，然后经过100V0.5h、500V0.5h、1000V1h、5000V1h，最后稳定在8000V下进行等电聚焦8.5h。一向电泳完后，取出IPG胶条先后置入平衡A液和平衡B液中各平衡15 min。平衡后的胶条移至浓度12.5%PAGE分离胶上端用0.5%琼脂糖封胶，2.5W电泳30 min，然后以11W恒功率电泳，直至溴酚蓝指示线到达凝胶底边处为止。整个操作过程避光进行。　　6.凝胶扫描和图像分析　　双向电泳完后，胶条取出擦洗干净，轻置 Typhoon扫描仪，以 Cy2，Cy3和 Cy5进行扫描并获得凝胶图像，设定的PMT值取整块胶或部分胶最大灰度值在60,000-90,000范围内为准。2D-DIGE分析胶图像用DeCyder V6.5软件进行分析。　　7.质谱样品制备　　选取差异明显的蛋白质点及空白胶(溴酚蓝线以外的胶)作为对照，切下的蛋白质点并置于1.5ml的EP管中(另取不同2-DE胶的匹配点和空白胶为对照)。振动洗涤3次后脱色、酶解、萃取，再抽干浓缩至2-5L，依次双蒸水、无水乙醇和100%ACN各点样板两次。每点样孔先均匀0.5L样品，再加0.5LCCA基质工作液于不锈钢板上，室温干燥待分析。　　8.质谱分析　　制备好的样品在洁净的空间内用压缩氮气吹样品靶的表面，接着输入ABI4800 MALDI-TOF/TOF质谱仪中进行分析。氮气激光对每个样品轰击1200次，随机选取40个点，每个点轰击30次。对肽质量指纹图谱进行校正取得 P M F（基质峰和胰蛋白酶自动降解离子峰作为内部标准）。　　9.蛋白质序列数据库查询　　将实验所得肽质量指纹图谱输入Mascot软件搜索MSDB和SWISS～PROT数据库进行检索，采用MS和MS/MS联合模式搜索数据库NCBInr和Swissprot数据库，将查询到的结果结合2D图谱上对应的分子量、等电点、覆盖率和匹配肽段等进行分析，取蛋白评分大于95%的为可信鉴定结果。　　10.差异蛋白的生物信息学功能分析　　首先利用亚细胞定位软件WOLF PSORT对鉴定的差异蛋白进行检索；再利用蛋白质数据库的蛋白质结构域和模体信息，对鉴定的蛋白质进行功能分组；最后运用String软件对鉴定的差异蛋白进行一级相互作用预测。　　11. Western blot验证　　为了验证Anxa2蛋白的表达变化情况，利用Western blot实验对DIGE结果进行验证。　　结果：　　1.非热毒血瘀LN组和正常对照组相比较，共找到了26个差异蛋白点，其中上调的有17个，下调的有9个。　　2.热毒血瘀LN组和正常对照组相比较，共找到了44个差异蛋白点，其中上调的有25个，下调的有19个。　　3.热毒血瘀LN组和非热毒血瘀LN组相比较，共找到了14个差异蛋白点，其中上调的有9个，下调的有5个。共鉴定出45蛋白质。　　4.32个蛋白存在胞浆定位，27个蛋白存在细胞核定位，22个蛋白在胞浆和细胞核均有定位，19个蛋白在线粒体定位，14个蛋白在细胞外定位，5个蛋白在胞浆和线粒体均有定位，3个蛋白在胞浆和胞膜均有定位，5个骨架蛋白定位，9个蛋白在内质网定位。　　5.差异蛋白功能主要归纳为以下6类：核苷酸结合蛋白类；细胞骨架蛋白类；分子伴侣蛋白类；膜运输蛋白类；功能调节蛋白类；代谢酶蛋白类。　　6.有23种蛋白质同时出现在蛋白质相互作用网络上。推测这些差异蛋白可能与免疫炎症反应早期细胞内促凝系统和抗凝系统的功能事件的调控有关。　　7. Anxa2、FTH1、SPARC和AnxA5蛋白可作为LN热毒血瘀证特异表达蛋白。　　8.Anxa2蛋白的表达变化与DIGE的结果一致。　　结论：　　与正常人和非热毒血瘀型LN患者相比，热毒血瘀型LN患者血清刺激的系膜细胞存在特异表达的蛋白，其中膜联蛋白A2、FTH1、SPARC和膜联蛋白A5可作为LN热毒血瘀证的生物标记及潜在的治疗靶点。