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中国是世界上重要的柑橘原生中心,在栽培的三个柑橘属植物中,无论是栽培种、品种、野生种、半野生种,还是天然的、人为的杂种等种质资源都极为丰富,除此之外,我国还有大量的柑橘近缘属植物。在这些资源中蕴藏着丰富的可供生产利用的重要基因资源。在分子生物学及基因组学迅速发展的今天,这些基因资源已成为世界柑橘科研强国争相争夺的对象。因此,开展柑橘基因组学研究对我国基因资源的保护、发掘和利用,保障我国柑橘业的永续发展至关重要。
人工染色体文库(artificial chromosome library)是包括柑橘在内的生物基因组学研究的基本材料,而细菌人工染色体文库(bacterial artificial chromosome library,BAC)具有遗传稳定、极少发生重排、转化率高、质粒易于分离提取、可直接进行末端测序等优点,因而是研究复杂基因组的主要文库。
作为我国柑橘基因组学研究的基础工作,本研究以我国特有椪柑品种岩溪晚芦(CitrusPoonensis Hort ex Tanaka cv.“Yanxiwanlu”)为实验材料,构建了柑橘细菌人工染色体文库,并利用该文库进行了部分乙烯调控基因的筛选,主要结果如下:
岩溪晚芦叶片经研磨破碎、过滤、差速离心收集细胞核,然后将细胞核洗涤并包埋于低熔点琼脂糖凝胶块中,在预实验确定的消化条件下,用限制性内切酶不完全消化成大片段DNA。大片段DNA经过2次脉冲电泳分离、切取含80-150kb的DNA凝胶后,再电泳浓缩一次,然后用电透析法回收。将回收的符合要求的DNA大片段与pCC1BAC载体连接构建含大片段柑橘DNA的载体,经多次电击转化感受态细菌DH10B,平板培养后将白色克隆一一挑入384孔板中进行单克隆培养,共挑选培养了167块384孔板,从而获得岩溪晚芦基因组DNA的BAC文库,文库保存于-80℃低温冰箱中。对文库的评价分析结果如下:文库的克隆总数约为61000个;外源DNA插入片段酶切分析显示它们的大小介于30-170 kb之间,平均为82kb左右;计算表明文库总容量相当于柑橘基因组的13倍,因而在理论上从该文库中找到任意单拷贝序列的概率为99.99%。多个克隆连续多次传代培养证实该文库遗传稳定,没有发生插入片段丢失和可检测到的变异。
为了进一步评价该文库的代表性,本研究进行了从文库中筛选基因的实验。将本BAC文库10个384孔培养板中的3840个克隆按板、行和列分别分级混合,得到该文库的混合板池、行池和列池。根据本实验室基因芯片分析结果,确定筛选7个受乙烯调控的候选基因,根据这7个基因的已知EST序列设计特异引物,用PCR对混合样本进行逐级筛选,确定PCR阳性克隆所在的行和列。实际筛选到了其中5个基因的阳性克隆,用基因特异引物直接测序BAC克隆,结果证实所筛选出的5个克隆均含有目标基因,表明文库代表性良好,同时也表明本研究所用的PCR筛选BAC文库的方法较之放射性同位素筛选法要更快速、更简便、且高效、安全。