目的:1.构建PSA真核表达质粒pcDNA3.1/His-Myc(-)B/PSA并大量制备和纯化蛋白。2.建立从小鼠骨髓前体细胞中分离、培养和扩增树突状细胞的方法;研究DC发育、分化和成熟过程中形态以及免疫生物学特性的改变;PSA融合蛋白冲击DC,构建前列腺癌DC瘤苗(PSA-DC),以癌组织裂解产物(lysate)、无关蛋白以及无抗原刺激的DC分别作阳性、阴性对照和空白对照。探讨影响DC瘤苗的体外功能活性及影响因素。3.实验观察瘤苗体内抗前列腺癌免疫治疗作用及免疫保护机制。方法:1.提取临床前列腺癌标本中癌细胞总RNA,逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)扩增PSA基因,构建真核表达载体pcDNA3.1/His-Myc(-)B/PSA,转化、抽提、扩增和纯化PSA。2.分离骨髓前体细胞,在联合加入GM-CSF和IL-4的条件下,大量制备骨髓DCs(bone marrow derived DC,BMDC),研究DC的生物学、免疫学特性。3.将PSA、癌细胞裂解产物冲击DC制备前列腺癌DC瘤苗、全细胞抗原瘤苗;检测前列腺癌DC瘤苗生物学活性,观察瘤苗刺激抗原特异性T细胞增殖活性和诱导抗原特异性CTL杀伤活性。4.建立前列腺癌LNCaP裸鼠、RM-1小鼠模型,观察该瘤苗对荷瘤小鼠的免疫治疗和免疫保护作用和保护机制。结果:1.将PSA基因插入真核表达载体pcDNA3.1/His-Myc(-)B中,构建pcDNA3.1(-)B/PSA表达载体。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳显示,扩增出1条特异的核酸片段(711bp),大小与预期一致。PSA基因的扩增片段纯化后与cDNA3.1/myc-his(-)B载体连接,经XhoⅠ和HindⅢ双酶切鉴定,琼脂糖凝胶电泳显示切出大小约700bp的目的片段和载体片段,表明系阳性克隆。pcDNA3.1/myc-his(-)B载体插入片断的测序结果经Blastn比对,与GenBANK登陆序列一致。RT-PCR电泳分析和Western blot方法证实从mRNA、蛋白水平证明转染成功。对阳性克隆进行CHO细胞大规模培养,最大细胞密度可达(3～9)×10~7cells/ml,重组蛋白产量200～800mg/L/d。经Ni2+螯合亲和层析,纯化得到电泳纯PSA融合蛋白,纯度可达90%。2.骨髓前体细胞在细胞因子GM-CSF加IL-4诱导下,体外经加入TNF-α培养7天后,可获得成熟DC。通过FACS分析,与正常第7天的DC相比,不同抗原成分冲击致敏和受到TNF-α刺激后CD40、CD80、CD86和Ia表达均可见上调。用CD11c作为检测DC纯度的标志,发现DC的纯度可以达到>95%。用ELISA法检测各实验组DC培养液上清中细胞因子的变化,PSA-DC和lysate-DC和OVA-DC组细胞因子IL-12p70和IL-1β均较non-DC组有明显的增加(P<0.05)。OVA特异性MF2.2D9肿瘤细胞检测抗DC提呈OVA可促进针对OVA增殖的肿瘤细胞明显增殖,而无关抗原并不能刺激OVA增殖克隆活化,清晰的说明DC抗原提呈功能存在抗原特异性。3.DC与CD4+T淋巴细胞混合淋巴细胞培养(MLR)显示,PSA-DC、lysate-DC组DCs刺激CD4+T细胞增殖的能力明显优于负荷无关抗原OVA-DC和non-DC组(P<0.01)。测定MLR反应中培养上清中细胞因子IL-2、IFN-r水平明显升高(p<0.01);IL-10和IL-4水平下调(p<0.05)。PSA-DC、lysate-DC组可产生针对PSA和肿瘤裂解物的DTH反应,而对无关抗原则无DTH效应。与OVA-DC, non-DC对照组相比,lysate-DC、PSA-DC组体外诱导的杀伤性T细胞对LNCaP细胞显示出较强的杀伤活性(p<0.05),且具有抗原特异性。4.建立裸鼠LNCaP前列腺癌模型。各组裸鼠皮下接种LNCaP细胞后第15天时将non-DC、OVA-DC、lysate-DC及PSA-DC各组体外诱导的CTL细胞经尾静脉过继输入,7天后重复治疗一次。治疗30天后,non-DC、OVA-DC、lysate-DC及PSA-DC各组瘤体大小分别为:152.3±7.4、45.4±6.5mm2、78.8±5.4和75.3±4.7 mm~2,存在明显差异(P<0.01)。治疗后第45天,各组瘤体大小分别为547.6±23.2、537.4±18.2、180.3±10.4和171.9±8.9 mm2,具有统计学意义(P<0.001)。non-DC、OVA-DC、lysate-DC及PSA-DC组平均生存时间分别为:44.9±5. 7、43.0±7. 2、85.6±12.1、93.5±8.9d,经log-rank分析表明,lysate-DC及PSA-DC组与对照组相比,生存时间明显延长(P<0.001)。5.建立RM-1前列腺癌小鼠模型。树突状细胞瘤苗先于7天尾静脉注入C57BL/6小鼠,导致RM-1细胞100%清除。树突状细胞瘤苗先于0天尾静脉注射,清除了50～60%(2～3/5)原发肿瘤。于0天尾静脉注射树突状细胞瘤苗,RM-1细胞接种15天后,non-DC、OVA-DC和Lysate-DC治疗组小鼠的瘤体平均直径分别为23.7±5.4mm, 22.1±4.9mm,4.3±2.6mm,说明与non-DC、OVA-DC相比,Lysate-DC能抑制肿瘤生长,统计学分析显示有显著性差异(P<0.01)。non-DC、OVA-DC组C57BL/6小鼠平均生存期分别为:15.8±2.6和16.6±3.2天,而于0天尾静脉注射Lysate-DC组平均生存期39.0±5.6天,统计学分析显示有显著性差异(P<0.01)。6. RM-1前列腺癌小鼠模型实验中采用了单抗+补体免疫去除CD4, CD8,或NK(NK1.1)细胞方法分析瘤苗治疗作用机理。实验证实去除了NK(NK1.1)细胞后,对RM-1肿瘤抑制作用降低了60%(2/5),去除CD4+T细胞RM-1抑制作用降低了20%(4/5),提示CD8+T、NK细胞在RM-1抗肿瘤免疫发挥重要作用,CD4+T细胞通过辅助CD8+T细胞而发挥作用。通过本试验证实RM-1全细胞抗原DC瘤苗可诱导保护性T细胞反应。结论:通过真核表达质粒PSA/pcDNA3.1/His-Myc(-)B的构建,可大量制备纯化的PSA蛋白。利用纯化的重组PSA蛋白冲击DC,制作DC瘤苗,体外实验证实了此种DC瘤苗具有体外抗原特异性保护功能。利用LNCaP前列腺癌裸鼠模型,验证了此种DC瘤苗体外产生的抗原特异性CTL经过继传输治疗,具有明确的抗前列腺癌作用;同时利用RM-1小鼠前列腺癌模型,验证了lysate-DC瘤苗体内抗前列腺癌的免疫治疗作用及免疫保护机制。本研究证明PSA特异性树突状细胞瘤苗具有治疗前列腺癌的潜在价值,为临床治疗提供了新选择。