本研究分为二部分：　　 第一部分：Stat3磷酸化抑制剂Flll32长循环脂质体的制备及抗肿瘤活性研究　　 复发或转移的肿瘤,恶性程度增加,对原治疗方法敏感性显著降低,极难治愈,是目前临床肿瘤治疗中遇到的最大难题之一。最新研究认为这种抗治疗效应是由于肿瘤中存在一类特殊的细胞亚群--肿瘤干细胞(Cancer stem cells)所致,肿瘤干细胞是肿瘤中少数具有自我更新能力(Self-renewal)并且能产生异质性肿瘤细胞的细胞。肿瘤干细胞对化学治疗相对耐药,对放射治疗不敏感。抵抗治疗而存活的肿瘤干细胞是导致肿瘤复发和转移的根本因为,因此研究针对肿瘤干细胞的靶向治疗将有助于开拓肿瘤治疗的新思路,为从根本上治愈肿瘤提供可能。　　 信号转导和转录活化因子3(STAT3)是EGFR、IL-6/JAK、SRC等多个致癌性酪氨酸激酶信号通道的汇聚的焦点,在多种肿瘤细胞中均发现有持续性过度激活,与肿瘤的发生发展有着密切关系。此外,STAT3能够调节肿瘤干细胞的自我更新能力和增殖能力,对肿瘤干细胞的生长和维持非常重要。这些生物学信息均提示我们,开发新的抗肿瘤药物,STAT3是一个非常具有吸引力的分子靶点。　　 本课题研究的化合物Flll32,最初设计的目的就是选择性靶向到STAT3。初步生物活性研究结果表明,Flll32特异性作用于JAK2/STAT3,抗肿瘤活性强。但是Flll32水溶性差的缺点,限制了进一步的体内生物活性研究,而且水溶性差,很可能会导致体内生物利用度低。而这一问题可以制备脂质体剂型来解决。　　 本文综述了肿瘤干细胞的发现、生物学特性以及在实体瘤中的研究进展,本文还综述了STAT3与肿瘤发生发展的密切关系,并简单介绍了脂质体的特性和作为药物载体的优点。本课题的研究内容包括制备Flll32长循环脂质体,优化剂型处方并对脂质体的物理参数进行表征；在此基础上研究Flll32脂质体体内外抗肿瘤活性以及对肿瘤干细胞的作用。课题的研究成果包括如下内容:　　 1.以薄膜水化一超声法制备了Flll32长循环脂质体,脂质体膜材由蛋黄卵磷脂(EPC)、胆固醇(Chol)和甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-DSPE)组成。通过考察Chol含量、EPC浓度以及药脂比对Flll32包封率的影响,确定了最佳处方为EPC:Chol:mPEG2000-DSPE:Flll32=18:2:1:2(摩尔比),其中EPC浓度为18mM。根据该处方制备的长循环脂质体,Flll32包封率高达97％以上,平均粒度为91.29±1.19nm(n=3)。　　 2.体外抗肿瘤活性研究中,通过细胞活性测定实验(WST-8法),检测化合物的细胞毒性；通过克隆形成实验,评价化合物对细胞增殖的影响；联合细胞周期测定、WesternBlot检测Cleaved PARP和Caspase-3功能活化测定实验,检测细胞凋亡；从蛋白和基因水平,评价化合物对STAT3及下游靶基因的影响。实验结果表明,Flll32能够有效抑制胰腺癌细胞的STAT3磷酸化,降低下游靶基因Bcl-xL(2)、Survivin、Cyclin D1和c-Myc的表达水平,进而抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡；Flll32与化疗药物联合使用具有协同作用,与放射治疗联合使用具有放射增敏作用。Flll32脂质体短时间作用活性稍弱于游离化合物,但长时间作用活性则强于游离化合物,且表现出安全性更高的优点。　　 3.体内抗肿瘤活性研究中,通过绘制肿瘤生长曲线和体积倍增曲线,评价化合物的抗肿瘤活性。实验结果表明,Flll32及其脂质体有效抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长延缓肿瘤倍增,而该作用是通过抑制STAT3磷酸化产生的。Flll32脂质体与放射治疗联合使用,几乎完全抑制肿瘤生长,效果大大优于二者单独使用,协同作用明显。　　 4.对肿瘤干细胞作用的研究中,Tumorsphere形成实验检测化合物对肿瘤干细胞自我更新能力的影响；以流式细胞仪检测ALDH+细胞比例,反映化合物对肿瘤干细胞比例的影响。实验结果表明,Flll32及其脂质体有效抑制Tumorsphere形成数目和体积,下调Panc1细胞和Panc1细胞移植瘤组织中ALDH+细胞比例,同时还能中和放射治疗升高ALDH+细胞比例的作用。因此推断Flll32作为STAT3磷酸化抑制剂,在杀死普通肿瘤细胞的同时也能杀死肿瘤干细胞。　　 第二部分：Gefitinib类似物生物活性筛选及优选化合物抗肿瘤活性研究　　 分子靶向治疗是近十年来逐渐发展起来的肿瘤治疗的新手段,所谓分子靶向治疗,是以肿瘤相关的分子为靶点,将药物等有效成分靶向定位到癌细胞,从而达到治疗肿瘤的目的。弥补了传统肿瘤治疗方法选择性低、毒副作用大的缺点。　　 EGFR是第一个与人肿瘤直接相关联的酪氨酸激酶,在多种上皮来源的实体瘤中表现出过表达；EGFR的活化在肿瘤的发生和发展中发挥着重要的作用,因为EGFR信号通路与促进细胞增殖和存活、抑制细胞凋亡相关。因此EGFR是肿瘤分子靶向治疗中一个很有吸引力的分子靶点。随着作用于EGFR小分子抑制剂Gefitinib、Erlotinib和Lapatinib相继进入临床使用,更是说明了人们对于EGFR作为分子靶点的关注。本文综述了EGFR与肿瘤的密切关系,以及作用于EGFR的酪氨酸激酶小分子抑制剂的研究进展。对本实验室以Gefitinib为先导化合物而设计合成的20个类似物进行抑制激酶活性和细胞毒性的生物活性筛选,对活性较好的化合物作进一步体内外抗肿瘤活性和作用机制研究。课题的研究成果包括如下内容:　　 1.生物活性筛选中,通过细胞活性测定实验(WST-8法),检测化合物的细胞毒性；使用激酶检测试剂盒,通过ELASA法体外检测激酶活性,考察化合物对激酶活性的抑制作用。结果表明,大部分新化合物对测试的6种人肿瘤细胞的细胞毒性均强于Gefitinib,抗肿瘤活性增强,但是对EGFR激酶的抑制作用均有不同程度的降低；化合物12、15、17、18和19有可能同时作用于EGFR、HER-2和c-MET,成为多受体酪氨酸激酶抑制剂。　　 2.对优选化合物15和17的体外抗肿瘤活性研究中,通过检测细胞生长曲线和克隆形成实验,评价化合物对细胞生长和增殖的影响；联合细胞周期测定、Western Blot检测Cleaved PARP和Caspase-3功能活化测定实验,检测细胞凋亡；联合Western Blot检测LC3-Ⅱ和转染GFP-LC3质粒观察斑点状分布,检测细胞自噬。研究结果表明,化合物15和17对HER-2高表达的人胰腺癌细胞Miapac2生长和增殖的抑制活性大大强于Gefitinib；化合物15和17通过诱导凋亡和自噬两种方式促进Miapac2细胞死亡,Gefitinib只通过较弱的诱导自噬的方式杀死细胞。这可能就是化合物15和17体外抗肿瘤活性大大强于Gefitinib的因为。　　 3.对优选化合物15和17的体内抗肿瘤活性研究中,通过对预处理细胞成瘤能力的检测,评价化合物抑制肿瘤形成的能力；通过绘制肿瘤生长曲线和体积倍增曲线,评价化合物的抗肿瘤活性。与Gefitinib相比,化合物15和17能够显著抑制裸鼠移植瘤的形成；相同剂量处理荷瘤裸鼠,化合物15和17抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长延缓肿瘤倍增的效果均强于Gefitinb。因此,化合物15和17通过抑制多条酪氨酸激酶信号通路,有希望取代当前的Gefitinib治疗或用于对Gefitinib耐受的治疗。