番茄Sly-miR393的克隆、鉴定及其功能研究

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MicroRNA(miRNA)是一类内源性的、长度为21~24个碱基的小分子非编码RNA,它通过对靶基因mRNA的降解或者抑制其翻译等方式,在转录后水平上特异调控靶基因的表达。miR393是植物中高度保守的miRNA,通过特异地调节生长素受体家族成员(TIR,AFB1,AFB2和AFB3),在生长素信号转导过程中发挥着重要的调控作用。   本文以番茄为研究材料,分离和鉴定了Sly-miR393及其靶基因,分析了它们在番茄中的时空特异表达模式。研究了番茄中Sly-miR393对靶基因的调控方式、对生长素反应等,为阐明Sly-miR393在番茄的生长素信号途径中的调控作用具有重要意义。本研究主要取得以下研究结果:   1、通过生物信息学方法,在番茄基因组数据库中筛选到能够形成完整茎环结构的Sly-miR393前体序列。以基因组DNA为模板,克隆了番茄Sly-miR393前体,并构建了以CaMV35S为启动子的超表达载体,即pLP35S-pre-SlymiR393。   2、采用农杆菌介导的番茄遗传转化法,获得了转基因番茄植株,并且通过RT-PCR技术验证了sLY-miR393在番茄中超表达。   3、Sly-miR393的表达模式表明,茎中的表达丰度最强,花中较强,根、叶、花蕾中表达温和。果实中表达丰度较低,并且随着果实后期成熟,表达水平逐渐下降。   4、根据miR393与其靶标mRNA之间的序列互补性,在番茄基因组数据库中寻找到三个生长素受体同源基因SlTIR,SlTIR1-like1和SlAFB,并且通过5’RACERT-PCR技术证实,在番茄体内Sly-miR393对靶基因SlTIR,SlTIR1-like1和SlAFB的转录本进行剪切降解。   5、利用定量PCR技术分析了靶基因在不同组织的特异性表达情况,发现Sly-miR393的表达模式与SlTIR1在叶和茎中,SlTIR1-like1在花蕾,SlAFB在花、黄果、叶组织中出现互补的关系。   6、对超表达Sly-miR393转基因株系研究结果显示,与野生型相比,转基因株系的主根变短:生长素处理后,发现在不定根、侧根的形成及对生长素的敏感性方面,转基因植株比野生型有显著降低;同时Sly-miR393超表达后不仅下调三个生长素受体同源基因的表达,而且改变了生长素应答基因的转录水平。由此,我们推断Sly-miR393通过调控生长素受体同源基因,影响了番茄中的生长素信号途径。
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