花生是我国重要的油料作物,油脂和蛋白质二者之和高达80%,是我国食用油和植物蛋白的主要来源。植物果实是多种农作物的收获器官,果实的正常生长和发育直接影响种子的产量和品质。花生荚果发育过程与其它植物有很大不同。花生开花受精后,受精卵仅进行少数几次分裂形成原胚后便停止进一步发育,而子房却不断伸长形成向地生长的"果针"。当果针将位于其顶端的胚珠推入土壤后,果针停止伸长,而胚胎的发育在黑暗的条件下重新启动,并最终膨大形成荚果。大量研究表明,光是调控花生荚果发育的关键因素。由于红光和远红光能可逆地影响花生胚珠的生长,因此,推测感受红光和远红光信号的光敏色素是调控花生荚果发育的关键因子。光信号转导途径在模式植物拟南芥中已经有较为深入的研究,光敏色素被光激活进入细胞核后,通过调控下游一系列基因的表达影响不同的生物学过程,如生长素的合成、运输和响应,赤霉素的合成和信号转导途径等。然而,光如何调控花生荚果发育的分子机制还不清楚。本研究首先分析了花生从受精至果针入土膨大过程中不同发育时期胚胎的形态变化,发现果针入土前后、荚果膨大前后是花生荚果早期发育的关键时期,因此选取未入土果针(S1)、入土后未膨大果针(S2)和入土顶端膨大形成"鸡头"形的果针(S3)为材料,进行高通量测序,分析了花生果针尖端胚胎着生部位(ER)和果针基部伸长区(BR)在这三个时期全基因组水平范围内基因的表达变化,并以花生栽培品种鲁花14号(LH14)为材料克隆了光敏色素基因家族,并对其序列特征、表达模式、蛋白积累水平以及在拟南芥和花生中的遗传转化进行了初步研究,同时还克隆了光敏色素互作因子PIF3,验证了 PIF3与花生光敏色素的相互作用,构建PIF3的诱饵载体,进行了酵母文库互作蛋白质的筛选。主要研究结果如下:(1)花生解剖学和形态学的观察结果表明,花生从开花到受精4d后,受精卵经过少数几次分裂形成"棒状"的原胚,同时果针不断向上生长;随后,"棒状"原胚暂停发育,而果针不断伸长并向地生长;果针入土 3d时,原胚开始恢复发育,胚柄伸长,同时果针顶端由入土前的紫色或绿色变为白色;果针入土9 d时,果针基部的胚发育成球形胚,此时,果针顶端膨大呈"鸡头"形。从开花到果针入土前,受精卵经历了从单细胞到"棒状"原胚的分裂过程,而在果针向地生长过程中,胚胎的发育处于相对静止状态;果针入土以后,胚胎在黑暗条件下重新启动发育,这一过程伴随荚果的膨大。(2)数字基因表达谱结果表明,光信号转导途径以及植物激素如生长素、赤霉素、脱落酸、细胞分裂素和乙烯的合成及信号转导途径中的关键基因在果针入土前后和荚果膨大前后在ER区和BR区的表达发生改变。例如,ER和BR区的LSD1蛋白、SPA1蛋白、向光素(phototropin)、早期光诱导的蛋白和root phototropism蛋白的编码基因在S2和S3时期的表达水平都低于S1时期的表达水平;ER和 BR 区的 indole-3-acetic acid-amido synthetase 基因在 S2 时期的表达水平均低于在S1时期的表达水平;ER区生长素诱导蛋白(auxin-induced protein)基因在S2时期的表达水平低于S1时期的表达水平,而BR 区该基因在S2时期的表达水平高于S1时期的表达水平;ER区的GA20氧化酶(gibberellin20oxidase)基因在S3时期的表达水平比S1时期和S2时期高,赤霉素调节蛋白(gibberellin-regulated protein)基因和 GA2 氧化酶(gibberellin 2-oxidase)基因在 S3 时期的表达水平比S1时期和S2时期低;BR区的赤霉素调节蛋白基因和GA20氧化酶基因在S2时期和S3时期的表达水平低于S1时期,GA2氧化酶基因在S2时期和S3时期的表达水平高于S1时期。果针发育的不同时期,我们在ER区鉴定到一些与荚果膨大的相关基因,包括WRKY、MYB、bHLH和MADS转录因子家族,以及参与细胞壁合成和降解、调控胚胎发育的相关基因等。(3)在两个野生花生Arachis duranensis和Arachis ipaensis中各鉴定到4个光敏色素,包括 phyA、phyA-like、phyB 和 phyE。phyA、phyA-like 和 phyB 在两个野生种中分别位于对应的染色体,且外显子数目相同,而phyE位于非对应的染色体且外显子数目不同。野生花生光敏色素基因的长度从2574 bp到3390 bp,氨基酸序列的长度从858 aa到1130 aa。(4)根据转录组和野生花生全基因组测序信息,利用RACE和同源克隆等技术在栽培花生LH14中克隆到AhphyA、AhphyA-like、AhphyB和AhphyE的全长 CDS 序列,分别为 3378bp、3378 bp、3456bp 和 3342bp,编码 1125 aa、1125 aa、1151 aa和1113 aa。花生四个光敏色素均包含N端的PAS结构域、GAF结构域、PHY结构域和C端的PRD结构域和HKRD结构域。系统进化分析表明,花生光敏色素与野生花生、大豆、百脉根、苜蓿和豌豆的光敏色素亲缘关系较近,与拟南芥、油菜、烟草等光敏色素的亲缘关系较远。(5)qRT-PCR分析发现,四个花生光敏色素基因在花生不同组织及花生果针不同发育时期的表达有差异。四个花生光敏色素基因在不同组织中均有表达,AhphyA、AhphyA-like和AhphyB在花中的表达量最高,而AhphyE在叶中表达量最高;AhphyA、AhphyA4-like、AhphyB和AhphyE在果针三个发育时期的表达差异不大。(6)Western Blot检测AhphyA和AhphyB在花生下胚轴及果针中的蛋白积累结果表明,与拟南芥相同,AhphyA在光照处理的下胚轴中降解,降解半衰期约为2 h,而AhphyB在下胚轴中的积累对光照处理不敏感;在花生果针的三个不同发育时期中,均未检测到AhphyA蛋白的积累,而在入土 9d的果针中检测到AhphyB的积累。结果表明,AhphyB蛋白可能在果针入土以后参与了花生荚果的发育过程。(7)AhphyA和AhphyB基因在拟南芥中的功能验证。构建AhphyA基因和AhphyB基因的过量表达载体,通过花序浸泡法转化拟南芥,经半定量PCR和Western Blot验证结果表明,AhphyA和AhphyB在拟南芥中正常表达。(8)远红光(FR)处理下,异源表达AhphyA基因的拟南芥下胚轴伸长受抑制的程度强于对照,可能是由于AhphyA基因过量表达增强了下胚轴对FR的敏感性,从而抑制了下胚轴的伸长;红光(R)处理下,异源表达AhphyB基因的拟南芥下胚轴伸长受抑制的程度强于对照,其长度显著低于野生型拟南芥的下胚轴长度,这说明在红光条件下,AhphyB具有抑制下胚轴伸长的功能。(9)AhphyA和AhphyB基因在花生中的转化。将AhphyA和AhphyB基因构建过量表达载体和干扰载体,通过花萼管注射法,将AhphyA和AhphyB基因的过量和干扰载体转化花生,经过PCR鉴定,已经初步获得了转基因阳性植株。(10)酵母双杂交实验结果表明,AhphyA、AhphyA-like和AhphyB的C端均能与 AhPIF3 互作,而 AhphyA、AhphyA-like 和 AhphyB 的 N 端均不与 AhPIF3互作。