目的:建立清肺口服液类黄酮组分物质基础库;基于网络药理学方法研究类黄酮组分的主要活性成分和抗RSV潜在作用靶标;研究清肺口服液类黄酮组分对RSV肺炎小鼠模型的防治作用,利用分子生物学技术结合靶标代谢组学方法聚焦Ⅰ型干扰素信号通路,探讨类黄酮组分抗RSV的可能作用机制。方法:类黄酮组分的纯化工艺与定性、定量检测方法:以药液质量浓度、树脂药材质量比、供试品pH、洗脱液体积、醇洗体积分数、洗脱体积流量为考察参数,并以类黄酮含有量为主要评价指标,正交试验优化聚酰胺树脂纯化工艺;应用电喷雾离子源(ESI),正负离子切换扫描模式采集样品MS/MS数据,通过MS-FINDER平台结合人工核对方法定性分析清肺口服液中类黄酮组分,同时使用UPLC-MS/MS,以CSH-C18色谱柱、ESI,负离子模式SRM方式进行定量分析26种类黄酮。类黄酮组分网络药理学分析:用Swiss Target Prediction与STITCH数据平台对前期鉴定出的76种类黄酮进行成分靶标预测;基于Phenolyzer平台获取RSV相关靶点,利用STRING及Cytoscape软件构建药物-成分-靶点-疾病相互作用网络,同时进行GO分析和KEGG通路富集研究。动物实验研究:利用空斑实验测定RSV毒力,通过RSV滴鼻诱发小鼠肺组织感染模型。造模12 h后使用类黄酮低、高剂量组进行灌胃给药,同时使用利巴韦林作为阳性对照,此外,在滴鼻造模前5天予以类黄酮预防性给药。在RSV感染第4与第6天对小鼠肺组织病理进行分析,并利用IHC方法分析Caspase-3的相对表达量,评价类黄酮对肺组织的保护作用。通过ELISA法和qPCR检测IL-1β、TNF-α、TGF-β1和IL-10水平,利用流式细胞技术分析CD4+与CD8+T淋巴细胞以及巨噬细胞比例,评价类黄酮组分对于RSV感染小鼠炎症反应和炎症细胞浸润的影响;分别通过qPCR和Western blot检测RSV的F、G、NS1的核酸转录水平和F蛋白的表达量,同时针对F蛋白和RSV使用IHC验证类黄酮对RSV复制的影响;通过ELISA法和qPCR分别检测血清IFN-β以及IFN-α、IFN-β mRNA水平;利用 qPCR 对 MDA5、RIG-I、TBK1、IRF3、JAK1、TYK2、MX1、TRIM5、ISG15、IP-10 mRNA 进行检测,并通过 Western Blot 检测 TBK1、IRF3、p-TBK1、OAS1 水平,以及利用IHC半定量检测MX1、OAS1蛋白水平,评价类黄酮对I型干扰素信号通路的影响;通过靶标代谢组学技术,检测RSV感染第4天小鼠血清、肺组织中与糖代谢、TCA相关的代谢产物水平,探讨类黄酮对RSV感染小鼠能量代谢产物的影响以及与固有免疫的联系。结果:(1)最佳纯化工艺参数为药液质量浓度24 mg/mL,树脂药材质量比25:3,上样液pH值4.0,5 BV水洗除杂,醇洗体积分数80%,醇洗体积6BV,洗脱流量3.0mL/min。纯化后,类黄酮含有量从18.5%提高至68.9%,转移率为78.7%。(2)共有440种类黄酮被初步鉴定出,其中负离子模式266种,正离子模式234种,有60种类黄酮在两种模式下均有良好响应;已知清肺口服液组方各单味药类黄酮共计146种,有78种被检测出;儿茶素、木犀草素等26种类黄酮能够同时被定量检测,其质量浓度与峰面积呈现良好的线性关系(R square>0.9978)。(3)76种类黄酮共挖掘靶标368个,得到与RSV感染共同靶点87个,槲皮素、木犀草素、芹菜素、山奈酚、木犀草苷是类黄酮中主要活性成分,靶标功能富集结果显示清肺类黄酮组分抗RSV作用机制主要与炎症通路、免疫调节、能量代谢、抗病毒感染等途径相关。(4)肺病理结果显示,RSV感染第4、第6天小鼠肺部均有严重的炎症反应,有大小不等的实变病灶、显著浸润的炎症细胞以及明显的血管组织、肺泡组织周边水肿。类黄酮高剂量和预处理组肺组织炎症评分低于模型组;RSV感染后,肺组织Caspase-3表达上调,类黄酮组可部分抑制Caspase-3水平。(5)ELISA、qPCR和流式细胞检测结果显示类黄酮高剂量和预处理组能有效降低IL-1β、TNF-α和TGF-β1炎症因子水平,上调抗炎因子IL-10;类黄酮组分治疗或预处理后有减少CD4+、CD8+T淋巴细胞以及巨噬细胞浸润的趋势。(6)肺组织中可检测到RSV特异性核酸,而在正常组中未检测出。模型组有较强的RSV复制,但肺组织中IFN-α、IFN-β mRNA上调不明显,类黄酮预处理或治疗后均可抑制F蛋白及其mRNA水平,同时对G、NS1核酸转录也有抑制作用,且均能有效上调IFN-αmRNA以及血清、肺组织中IFN-β蛋白水平,对IFN-β mRNA有上调趋势。(7)与正常组相比,模型组TBK1、IRF3mRNA的水平呈现出与RIG-I mRNA相似的上调作用,同时IRF3、p-TBK1蛋白也显著上调,TBK1有上调趋势,对JAK1、TYK2转录无影响,能够提高MX1、TRIM5、ISG15、IP-10转录水平和OAS1蛋白含量;类黄酮高剂量和预处理均能促进TBK1磷酸化,提高JAK1、IP-10、ISG15 mRNA水平,对TYK2 mRNA无影响,对OAS1蛋白有上调作用。(8)与正常组相比,模型组血清中丙酮酸、乳酸、顺式乌头酸均上调,琥珀酸、3-磷酸甘油酸有上调趋势,α-酮戊二酸有下调趋势;类黄酮高剂量组能够逆转RSV感染诱导的丙酮酸、乳酸、顺式乌头酸、3-磷酸甘油酸的上调,能够下调血清苹果酸水平,有降低琥珀酸趋势;利巴韦林的干预造成了血清中乳酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、α-酮戊二酸、磷酸烯醇式丙酮酸、柠檬酸进一步上调。与正常组相比,模型组肺组织中丙酮酸、乳酸等1 1种目标代谢物均显著上调;类黄酮高剂量组能够逆转RSV感染诱导的肺组织乳酸、3-磷酸甘油酸、富马酸、苹果酸、葡萄糖的上调,能够进一步上调肺组织丙酮酸水平,有降低磷酸烯醇式丙酮酸、琥珀酸趋势;与模型组比,西药利巴韦林的干预可以下调葡萄糖、磷酸烯醇式丙酮酸水平,但造成了肺组织更高水平的乳酸堆积。结论:(1)采用聚酰胺树脂纯化清肺口服液中的类黄酮稳定可靠、效果良好;运用MS-DAIL联合MS-FINDER分析鉴别类黄酮简单高效,可作为初步鉴定中药类黄酮成分的首选方法。(2)UPLC-QE-Orbitrap-MS结合MS-FINDER可快速定性分析清肺口服液中的类黄酮;利用UPLC-MS/MS技术,使用CSH-C18色谱柱可以高效、可重复的同时定量检测清肺口服液类黄酮组分中26种类黄酮。(3)通过LC-MS与网络药理学研究方法,获得清肺口服液类黄酮组分抗RSV的作用机制主要与炎症通路、免疫调节、能量代谢、抗病毒感染等途径相关,证实了复方多靶点、多途径的治疗特点。(4)每只BALB/c小鼠给予5 × 10^5 PFU的RSV滴鼻可引起显著的肺组织炎症反应和病理损伤;类黄酮组分可有效抑制炎症反应,改善肺组织病理损伤,减少炎性细胞浸润和细胞凋亡,同时RSV滴鼻造模能够在肺组织检测到RSV特异性核酸和蛋白,而类黄酮治疗可有效抑制RSV复制。(5)RSV感染可抑制宿主细胞Ⅰ型IFN的转录,干扰机体正常的抗病毒免疫反应,同时造成宿主血清、肺组织能量代谢紊乱,乳酸堆积;类黄酮可激活Ⅰ型IFN信号通路,促进TBK1磷酸化,上调抗病毒蛋白水平,改善RSV诱导的代谢紊乱,同时类黄酮能够有效预防RSV感染,激活宿主Ⅰ型干扰素信号通路,对宿主能量代谢失衡也有一定预防作用。(6)类黄酮所表现出的激活Ⅰ型干扰素信号通路作用可能是通过拮抗TGF-β1活性、与病毒非结构蛋白结合、改善宿主能量代谢并下调乳酸水平等方式间接实现。(7)利巴韦林能够有效抑制RSV的复制,但在改善肺组织病理损伤、炎症反应等方面不及类黄酮,且能够引起宿主更强烈的能量代谢紊乱,诱导血清、肺组织乳酸水平升高,抑制宿主细胞正常的抗病毒免疫功能,这可能是临床使用不能获益的内在原因。