经典Wnt信号通路在γ射线致斑马鱼胚胎神经发育毒性中的作用机制研究

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目的:通过研究在γ射线作用下,对斑马鱼胚胎发育的影响,进一步探讨在γ射线辐照后下,经典Wnt信号通路对斑马鱼胚胎神经发育毒性中的作用机制研究。  方法:以AB系斑马鱼为材料,用生物辐照仪对发育至5小时的斑马鱼胚胎进行不同辐照剂量的γ射线辐照(0 Gy、0.25 Gy、0.5 Gy、1.0 Gy、2.0Gy),探索经典Wnt信号通路在γ射线致斑马鱼胚胎神经发育中的作用:①电子显微镜下观察2.0Gyγ射线对斑马鱼胚胎形态学的变化;②镀银染色观察不同剂量γ射线对48、72hpf斑马鱼胚胎脑部神经细胞的形态变化;③斑马鱼胚胎死亡率、致畸率、出膜率的统计;④RT-PCR检测0.5Gyγ射线对斑马鱼胚胎不同发育时间点的Wnt3a、Dvl2、β-catenin mRNA的表达水平变化;⑤Western blot检测0.5Gyγ射线对斑马鱼胚胎不同发育时间点的Wnt3a、Dvl2、β-catenin蛋白的表达水平变化。  结果:  1.以0 Gy、0.25 Gy、0.5 Gy、1.0 Gy、2.0Gy的γ辐射分别对发育至5小时的斑马鱼胚胎进行辐照后,光学显微镜下观察胚胎发育至6hpf、12hpf、24hpf、36hpf、48hpf、72hpf的形态学。结果显示:受不同剂量的γ射线辐照后的斑马鱼胚胎生长发育受到了不同程度的影响,其中在2.0Gy剂量组下对斑马鱼胚胎发育影响尤为明显,2.0Gyγ射线辐照24hpf斑马鱼胚胎出现了发育滞后;48hpf的斑马鱼胚胎出现脊柱弯曲;72hpf的斑马鱼胚胎出现尾部发育畸形、心包囊水肿。  2.统计不同辐照剂量组对48hpf斑马鱼胚胎出膜率、72hpf斑马鱼胚胎致畸率、72hpf斑马鱼胚胎死亡率的统计。结果显示:出膜率在0.5Gy剂量组后开始明显的降低,与对照组0Gy相比,出膜率有统计学差异(P<0.05);致畸率在0.25Gy开始就有上升的趋势,与对照组0Gy相比,致畸率有统计学差异(P<0.05);死亡率在0.5Gy剂量组后有明显的升高趋势,可认为0.5Gy剂量γ射线对斑马鱼胚胎发育有一定的敏感性。  3.用镀银染色法观察48hpf、72hpf斑马鱼脑部神经细胞的形态变化。结果显示:48hpf斑马鱼胚胎在1.0Gy剂量下出现脑部神经细胞排列紊乱,2.0Gyγ射线照射下的脑部神经细胞间间隙增大;72hpf斑马鱼胚胎2.0Gyγ射线照射下的脑部神经细胞着色深浅不一。  4.以0、0.5Gy的γ辐射分别对发育至5小时的斑马鱼胚胎进行辐照后,用半定量RT-PCR检测斑马鱼胚胎在6hpf、12hpf、24hpf、36hpf、48hpf、72hpf六个发育时间点的Wnt通路相关基因的表达变化。结果显示:在发育过程中Wnt3a、、β-catenin mRNA的表达有县增高后降低的趋势,Dvl2 mRNA的表达逐渐降低;剂量组在发育后期Wnt3a、Dvl、β-catenin mRNA的表达有明显抑制作用。  5.以0、0.5Gy的γ辐射发育至5小时的斑马鱼胚胎进行辐照后, Western blot检测斑马鱼胚胎在6hpf、12hpf、24hpf、36hpf、48hpf、72hpf六个发育时间点的Wnt信号通路相关蛋白的表达变化。结果显示:Wnt3a、Dvl2、β-catenin在斑马鱼胚胎发育过程中有先增高后降低的趋势,则在生长发育高峰期表达增高。辐照组与对照组比较, Wnt3a、Dvl2、β-catenin蛋白的表达受到抑制。  结论:  1.较低剂量(0.25Gy~2.0Gy)的γ射线能引起斑马鱼胚胎神经发育毒性,可能通过经典Wnt信号通路调控斑马鱼胚胎的神经发育。  2.发育早期(5hpf)的斑马鱼胚胎可作为低剂量辐射0.5Gy生物预警的敏感模式动物,Wnt3a、Dvl2、β-catenin的基因及其蛋白表达可作为敏感生物标志物。
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