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第一部分紫外线照射SKH-1无毛鼠构建日光性角化病和鳞癌模型目的:紫外线照射可诱导日光性角化病(AK)发生及向鳞状细胞癌(SCC)进展,PIKKs/Akt信号通路参与多种肿瘤发生,可能在紫外线诱导SCC形成中亦发挥重要作用,本研究探讨紫外线诱发皮肤SCC发生及AK向SCC转化过程中PIKKs/Akt信号通路的DNA-PKcs的变化。方法:①将43只SKH-1无毛小鼠随机分成实验组1(26只)、实验组2(7只)和对照组(10只)。实验组采用SUV-1000日光模拟器模拟日光照射SKH-1无毛鼠,第1-2周采用UVA和UVB混合的亚红斑剂量(90%MED)照射。随着实验进展,小鼠皮肤厚度逐渐增加,对紫外线的耐受力增加,紫外线照射剂量不断进行微调。紫外线剂量于第3周增至1 MED,以后每周递增12.5%MED,到第8周照光剂量增至每日260mJ/cm2,以后维持该剂量进行照射,对照组不做任何处理;实验组1维持照射至24周,实验组2维持照射至16周;在第12、18、24、28周分别处死小鼠行皮肤组织病理检查。②于第2、6、12、16、20、24及28周行皮肤生理功能检测;③于28周取同一只小鼠背部不同皮损行组织病理检查和免疫组化检测。结果:①12周后实验组部分小鼠背部皮肤增厚,皮棘隆起皮沟加深,皮肤弹性下降;17周开始实验组1和实验组2小鼠背部皮肤陆续出现直径≥1 mm的丘疹,之后两组小鼠背部丘疹增多、增大;照射28周后成瘤率达100%。对照组未见肿瘤形成。组织病理显示:实验组第12周呈现表皮角化过度,棘层肥厚,未见异型性细胞;18周后病检呈现棘层肥厚,表皮下方细胞轻度异型,具备AK的病理形态特征;24周,棘层明显肥厚,表皮细胞中-重度异型,部分呈全层原位癌表现;28周100%的小鼠病检呈现表皮下细胞异型性,核聚集成堆,棘层肥厚,非典型增生具有SCC特征;实验组1和实验组2于28周均出现皮肤SCC模型,实验组1小鼠背部皮疹更多,弹性下降明显。②皮肤生理功能检测显示,与对照组相比,照光组的皮肤PH和红斑含量于试验第2周均出现差异,皮肤角质层含水量、经皮水分丢失、皮肤黑素含量于照光第12周出现差异;③在紫外线诱发SCC发生过程中,经历光老化、AK样、原位癌样和浸润性SCC,DNA-PKcs和p-DNA-PKcs(T2609)均细胞定位于细胞质和细胞核,表皮组织中DNA-PKcs表达含量增加,差异有统计学意义,而p-DNA-PKcs(T2609)无差异。结论:1.成功制备小鼠AK样模型和SCC模型;2.阐明紫外线诱导SCC发生发展是渐变性过程,与紫外线剂量的累积效应有关;3.明确了紫外线照射SKH-1无毛鼠构建皮肤SCC模型过程中,涉及皮肤屏障受损、诱发DNA损伤及修复等过程。第二部分生物信息学分析及皮肤组织水平验证目的:TGF-β1/Smad信号通路对早期肿瘤抑制肿瘤细胞生长,对晚期肿瘤却促进肿瘤侵袭转移,在人皮肤AK和SCC中的作用机制未见报道。PIKKs/Akt信号通路在肿瘤发生中发挥重要作用,但在AK和SCC作用亦未见有报道,本研究在组织水平上探讨AK及SCC中TGF-β1/Smad和PIKKs/Akt信号通路的作用机制及AK和SCC发生和转化的机制。方法:1.采 用 网 站 http://scangeo.dartmouth.edu/ScanGEO/和http://www.cbioporta1.org/对前期表达谱芯片测序的文章和癌基因组学信息进行分析,查找TGF-β1/smad和PIKKs/Akt信号通路的表达谱差异。2.收集正常避光部位、曝光部位皮肤组织及AK和SCC皮损组织,行皮肤组织蛋白免疫印迹,检测四组皮肤组织中两条信号通路中关键蛋白表达水平。结果:1.生物信息学分析正常皮肤、AK和SCC组织表达谱芯片测序结果,与正常皮肤、AK比较,SCC中Smad3和TGF-β1表达增加,TGF-βRI表达是下调的。在AK、SCC中,DNA-PKcs升高,mTOR是下调的。组织蛋白免疫印迹结果显示,组内总体差异比较,有统计学意义的是:TGF-βRI、p-Smad3(S423/425);组内两两比较,有统计学差异的是:p-Smad3(S423/425)和Smad4正相关,TGF-β1和Smad4相关。与避光对照皮肤组织相比,TGF-βRI在曝光部位皮肤、AK和SCC中表达水平下降,DNA-PKcs及p-DNAPKcs(T2609)蛋白表达增加,且p-DNAPKcs(T2609)和p-H2AX(S139)正相关。结论:TGF-β1/Smad与PIKKs/Akt信号通路在AK和SCC表达存在差异,提示这两条信号通路参与皮肤SCC发生、发展过程。p-H2AX(S139)(γ-H2AX)可以反映p-DNAPKcs(T2609)水平及DNA损伤修复情况。第三部分TGF-β1/Smad与PIKKs/Akt信号通路抑制剂作用不同角质形成细胞细胞生物学及分子水平的研究目的:前期在组织水平研究发现,TGF-β1/Smad与PIKKs/Akt信号通路在AK和SCC表达存在差异,提示这两条信号通路参与皮肤SCC发生、发展过程。本研究探讨TGF-β1/Smad与PIKKs/Akt信号通路的在不同角质形成细胞的作用机制,推测紫外线诱发AK向SCC发生转化的可能机制。方法:分别培养HaCaT细胞、UV-HaCaT细胞及SCL-1细胞;选择PIKKs/Akt信号通路中 DNA-PK 抑制剂-NU7026、Akt 抑制剂-Perifosine,TGF-β1/Smad信号通路中TGF-βR Ⅰ/Ⅱ抑制剂-LY2109761、Smad3抑制剂-SIS3,4种信号通路抑制剂分别干预3种角质形成细胞,活性调控处理48h后,1.通过CCK8法、EdU试验、克隆形成试验和流式细胞术检测细胞活力、增殖、细胞成瘤能力以及凋亡影响;2.使用蛋白免疫印迹技术检测细胞信号通路干扰后其相关蛋白表达及蛋白磷酸化水平。结果:NU7026、Perifosine、LY2109761 和 SIS3 分别作用 HaCaT、UV-HaCaT和SCL-1细胞48h后:1.CCK8结果显示不同浓度抑制剂作用细胞,随着作用浓度增高,细胞活力下降,且呈浓度依赖性;2.经HE染色、显微镜下观察细胞克隆形成试验结果,对照组细胞为扁平的多角形,均质性且折光性强,生长状态良好,细胞间相互衔接,排列紧密,融合成片;抑制剂作用后,细胞均略皱缩变圆,细胞间隙拉宽,散在悬浮细胞;克隆细胞数量明显减少;3.EdU结果:NU7026、Perifosine和SIS3对三种细胞增殖具有抑制作用,而LY2109761对UV-HaCaT细胞增殖有抑制作用,但对HaCaT和SCL-1无明显影响,UV作用HaCaT细胞,促进细胞增殖;4.流式细胞术结果表明:Perifosine对HaCaT细胞晚期凋亡有抑制作用,而LY2109761对HaCaT细胞的早期凋亡无明显作用,但能抑制该细胞晚期凋亡,除此之外,其余抑制剂均有促进细胞凋亡作用,而UV作用HaCaT细胞,抑制细胞凋亡;5.细胞蛋白免疫印迹研究TGF-β1/Smad与PIKKs/Akt信号通路相互影响,结果显示:NU7026作用SCL-1细胞,Akt的磷酸化受抑UV-HaCaT细胞磷酸化Smad2下降,HaCaT细胞Smad3的磷酸化水平升高。Perifosine对三种细胞γ-H2AX无明显影响,HaCaT细胞中Smad2表达水平下降,UV-HaCaT细胞Smad2、磷酸化Smad2下降,SCL-1细胞Smad2亦同样下调。LY2109761作用后UV-HaCaT细胞的Akt表达下调,SCL-1细胞的Akt磷酸化受抑,同时γ-H2AX在SCL-1表达水平升高。SIS3作用后虽未影响Akt的磷酸化,但促进总Akt表达,在UV-HaCaT和SCL-1细胞中,p-S6(S235/236)水平下降。结论:PIKKs/Akt信号通路在紫外线诱导AK和SCC发生中有促癌作用;而TGF-β1/Smad信号通路对不同阶段角质形成细胞的细胞生物学作用存在差异;在正常角质形成细胞中发挥抑制生长的作用,在肿瘤细胞中发挥促癌作用。同时,TGF-β1/Smad与PIKKs/Akt信号通路间存在交互作用,TGF-β1/Smad在正常细胞中抑制PIKKs/Akt的促癌活性,从而发挥抑制恶变作用;在肿瘤细胞中则促进了 PIKKs/Akt的促癌活性,癌细胞的增殖和存活能力增加。DNA-PKcs/Akt在正常细胞中抑制TGF-β1/Smad发挥抑癌作用,在肿瘤细胞中,则促进了TGF-β1/Smad信号通路激活,从而促进了癌细胞的进一步发生、发展。第四部分TGF-β1/Smad与PIKKs/Akt信号通路对皮肤鳞状细胞癌发生浸润和转移机制的研究目的:EMT可以增加癌细胞侵袭和转移能力,在皮肤SCC的发生、发展进程中发挥重要作用;而DNA-PKcs参与多种恶性肿瘤的发生和发展。本研究探讨DNA-PKcs在皮肤SCC发生浸润和转移的机制,以及TGF-β1/Smad与PIKKs/Akt信号通路是否参与皮肤SCC的EMT过程。方法:本研究中利用细胞生物学-细胞划痕实验及Transwell侵袭和迁移实验检测DNA-PKcs及TGF-β1/Smad信号通路对细胞侵袭和迁移能力的影响,分子生物学方法-RT-PCR探索EMT相关基因表达水平,细胞免疫荧光和Western blotting检测EMT及TGF-β1/Smad和PIKKs/Akt信号通路标志性蛋白表达情况,进而揭示皮肤SCC发生侵袭和转移的机制,探索TGF-β1/Smad与PIKKs/Akt信号通路在皮肤AK向SCC转化过程中肿瘤细胞发生浸润和迁移可能的作用机理。结果:DNA-PKcs在人SCC组织和SCL-1细胞中表达水平显著上调。通过DNA-PK抑制剂NU7026或转染s i RNA来实现DNA-PKcs干扰,划伤愈合实验和Transwell侵袭、迁移实验均提示细胞的运动能力下降,同时检测EMT相关蛋白,E-cadherin表达增加,而Vimentin蛋白水平下降。TGF-β1可诱导SCL-1细胞EMT,促进SCC的侵袭和转移,同时磷酸化DNA-PKcs使其活化。此外,Western blotting显示,TGF-β1促进Smad2/3的磷酸化,而干扰DNA-PKcs可下调SCL-1细胞中p-Smmad3水平。同时抑制DNA-PKcs和TGF-β1/Smad通路,明显抑制细胞的侵袭和迁移,但E-cadherin表达却减少。结论:DNA-PKcs可通过TGF-(31/Smad通路促进EMT发生,促进SCC细胞的迁移、侵袭。TGF-β1/Smad与PIKKs/Akt信号通路之间的交互作用参与紫外线诱导日光性角化病向鳞状细胞癌转化。此外,除了TGF-β1/Smad通路,DNA-PKcs可能参与其他细胞信号通路来调节EMT。