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乳腺癌是女性当中常见的恶性肿瘤,同样也是全球最常见的三种癌症之一。近年来,尽管对癌症研究取得了巨大的进步,但乳腺癌仍然是影响女性健康的一个重大健康问题。三阴性乳腺癌约占所有乳腺癌病例的10-20%,具体表现为一种雌激素受体、孕酮受体以及人表皮生长因子受体-2均为阴性的乳腺癌,由于缺乏相应的治疗靶点,相比于其他亚型,三阴性乳腺癌发病率高,治疗后的局部复发率、远端转移率较非三阴性乳腺癌高,预后差,因此迫切需要了解乳腺癌发展的机制,寻找到有效的诊断和预后指标及治疗靶点,对改善三阴性乳腺癌的治疗将具有重要意义。miRNA,一种长度大约为19-22nt的单链小分子非编码RNA,占人类基因的3%,调节着约30%的蛋白质编码基因。据报道,miRNA表达水平的异常往往与各种疾病的进展存在着密切关系。miR-29b-3p的表达异常在很多疾病中被发现,但是其在三阴性乳腺癌中的表达以及作用机制尚未有研究报道。研究目的:1、检测三阴性乳腺癌细胞系以及正常乳腺上皮细胞系中miR-29b-3p的表达水平。2、探索miR-29b-3p在三阴性乳腺癌发生发展过程中的作用3、生物信息学预测并鉴定miR-29b-3p的潜在靶基因。4、探索miR-29b-3p对三阴性乳腺癌的作用机制。研究方法:1、提取人正常乳腺上皮细胞系MCF-10A以及三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231总RNA,通过实时荧光定量PCR检测miR-29b-3p的表达水平情况。2、合成miR-29b-3p mimics以及miR-29b-3p inhibitor并转染,进行功能获得性以及功能缺失性研究。CCK8实验检测转染后对三阴性乳腺癌细胞的细胞活力;细胞克隆形成实验检测转染之后的细胞增殖能力;细胞划痕实验以及Transwell实验检测转染之后细胞的迁移和侵袭能力;Hoechst实验、Tunel实验以及Annexin V-FITC/PI实验检测转染之后细胞的凋亡情况;免疫荧光实验检测转染后对细胞骨架的影响。3、利用生物信息学网站Targetscan以及miRDB预测miR-29b-3p的潜在作用靶点,并使用双荧光素酶报告基因实验加以验证。4、Western blot实验检测miR-29b-3p作用的机制。研究结果:1、miR-29b-3p在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中过表达。三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中miR-29b-3p的表达水平较正常乳腺上皮细胞系MCF-10A高,具有统计学上的显著性差异(P<0.01)。2、miR-29b-3p inhibitor抑制MDA-MB-231细胞活力以及增殖能力。CCK8实验结果表明,miR-29b-3p inhibitor转染后,细胞的细胞活力较阴性对照组明显降低,且具有显著性差异(P<0.01);细胞克隆形成实验结果表明,在与阴性对照组相比,miR-29b-3p mimics能显著促进细胞增殖而miR-29b-3p inhibitor却显示出抑制效果。3、miR-29b-3p促进MDA-MB-231细胞迁移和侵袭。细胞划痕实验以及Transwell实验表明,转染miR-29b-3p inhibitor之后,与阴性对照组对比,细胞的迁移以及侵袭能力都受到了抑制(P<0.01)。4、miR-29b-3p inhibitor诱导MDA-MB-231细胞凋亡。转染后,与阴性对照组相比较,Hoechst染色实验显示miR-29b-3p inhibitor诱导MDA-MB-231细胞产生凋亡小体;并且在Annexin V-FITC/PI以及Tunel实验当中显示,miR-29b-3p inhibitor使MDA-MB-231细胞凋亡数明显比阴性对照组多,并且检测到Cleaved PARP的产生,说明miR-29b-3p inhibitor可以诱导MDA-MB-231细胞凋亡。5、miR-29b-3p inhibitor影响MDA-MB-231细胞细胞骨架的形成。免疫荧光实验,对细胞骨架中的重要组成成分,α-Tubulin,进行观察,结果显示miR-29b-3p inhibitor使细胞骨架皱缩,而阴性对照组当中细胞骨架完好,说明miR-29b-3p inhibitor影响MDA-MB-231细胞细胞骨架的形成。6、miR-29b-3p靶向TRAF3。通过构建psi-CHECK2/TRAF3 3’-UTR wt以及psi-CHECK2/TRAF3 3’-UTR mt载体,分别与NC,miR-29b-3p mimics,miR-29b-3p inhibitor共转染,随后进行双荧光素酶报告基因实验,结果显示,在psi-CHECK2/TRAF3 3’-UTR wt中,与阴性对照组相比,miR-29b-3p能与TRAF3基因3’UTR结合,从而抑制萤光素酶的活性(P<0.01),而miR-29b-3p inhibitor在细胞中能抑制内源miR-29b-3p与TRAF3基因3’UTR结合,从而使萤光素酶的活性增加(P<0.05),而在TRAF3 3’-UTR mt中,各组的荧光素酶活性没有达到统计学上显著性变化,说明TRAF3为miR-29b-3p的一个靶基因。7、NF-κB信号通路在MDA-MB-231的发生发展过程发挥着重要作用。Western blot检测NF-κB信号通路的关键蛋白,结果显示,与阴性对照组相比,miR-29b-3pinhibitor抑制关键蛋白的表达,而miR-29b-3pmimics却使其显着增加。结论:miR-29b-3p在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中过表达,经过miR-29b-3p inhibitor转染后,抑制了MDA-MB-231的发展,其增殖能力以及细胞活力都有所下降并诱导凋亡,并影响微管的形成影响迁移以及侵袭的过程。miR-29b-3p靶向TRAF3 3’-UTR,并激活NF-κB信号通路参与到MDA-MB-231的发生发展过程中,因此miR-29b-3p在三阴性乳腺癌中是一种潜在的生物标志物,其有望成为治疗三阴性乳腺癌的新型靶点。