血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)是血管中膜的重要组成成分,它的异常增殖与迁移在高血压、动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)、血管成形术后再狭窄等心脑血管疾病的发生、发展中起着重要的作用。胞外分泌复合体(exocyst)是一个由从酵母到人类进化上保守的八个亚基蛋白质构成的复合结构,在细胞的胞外分泌过程发挥主要作用。Exo70是exocyst中的关键组分,它在酵母中主要参与分泌囊泡与靶膜的锚定与融合。而在哺乳动物细胞中,Exo70不仅参与了细胞分泌,在HeLa等多类细胞的迁移过程中也发挥作用。为了进一步明确Exo70在血管平滑肌由中膜向内膜迁移过程中的作用,本实验以血管平滑肌细胞A7r5细胞作为实验研究对象,利用细胞生物学、分子生物学、生物化学等实验方法,对Exo70在A7r5细胞中的表达和定位情况,以及Exo70功能缺失前后A7r5细胞迁移和侵袭能力的变化等方面进行了研究。主要实验结果如下:(1)Exo70在平滑肌细胞A7r5中的表达情况RT-PCR及免疫荧光检测结果表明,在A7r5细胞中Exo70可以在mRNA水平和蛋白水平上表达,且Exo70的表达主要分布于A7r5细胞的胞质中。(2)Exo70在A7r5细胞中的亚细胞定位利用免疫荧光标记法检测了A7r5细胞中Exo70与细胞骨架的共定位情况。实验结果显示,在A7r5细胞中Exo70是与Actin存在共定位的,与Tublin并不存在共定位现象。为了进一步验证该结果,利用细胞松弛素B处理细胞1h后,Actin发生了解聚,与此同时Exo70在胞质中的分布呈现出弥散状,该实验表明Exo70是与微丝相互作用从而发挥功能的。利用免疫荧光双标记检测了A7r5划伤体系中Exo70的定位情况。结果显示,Exo70与Actin共定位于迁移的A7r5细胞边缘。说明Exo70与Actin主要共定位于迁移细胞的边缘,从而发挥功能。(3)Exo70在平滑肌细胞A7r5迁移过程中的作用为了进一步明确Exo70在A7r5细胞转移过程中的作用,于是利用RNA干扰技术抑制了A7r5细胞中Exo70的基因表达,筛选出了Exo70功能缺陷的A7r5细胞株:A7r5-ratExoc7-D2和A7r5-ratExoc7-K1细胞。并以野生型A7r5为对照,对三株细胞进行划伤愈合实验,结果显示A7r5细胞干扰前后划伤结果有明显差异,其中A7r5-ratExoc7-D2细胞划痕愈合所需时间最长,其次为A7r5-ratExoc7-K1细胞,这表明了抑制了Exo70在A7r5细胞中的表达后,细胞的迁移能力降低,进一步证明Exo70的表达水平与细胞的迁移能力呈正相关。(4)Exo70在平滑肌细胞系A7r5侵袭过程中的作用为了进一步明确Exo70在A7r5细胞转移过程中所发挥的功能,选取上述筛选的功能缺陷型细胞进行Transwell实验,正常A7r5细胞做对照,检测三株细胞的侵袭能力。结果表明,迁移到下室内的细胞数量,A7r5-rat Exoc7-D2和A7r5-rat Exoc7-K1细胞明显的少于A7r5细胞。说明了抑制了Exo70在A7r5细胞中的表达后,细胞的侵袭能力降低。Exo70在A7r5细胞的迁移和侵袭过程中确实发挥了重要的作用。本研究明确了Exo70在VSMC中的表达与定位特性及在VSMC迁移过程中所发挥的功能,有助于进一步的了解心血管疾病的发病机理,为心血管疾病的治疗提供新的潜在治疗靶点。