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MS5(male sterile5)基因又名POLLENLESS3基因或TDM1基因。MS5最早在拟南芥发现,且是一个育性相关的基因,MS5突变会导致雄性不育。相关研究显示,它在调控细胞周期活动及在发育的花药细胞的减数分裂过程中起着关键作用。MS5突变体由于在第二次减数分裂后出现了一次额外的分裂,而染色体没有复制,结果导致染色体异常,出现多分体。其编码的蛋白产物类似小鼠联会复合体蛋白SCP1,遗传分析显示它是一个细胞核隐性孢子突变体(Chaudhury et al.,1994)。MS5基因属于一个植物界中高度保守的小的多基因家族的成员。李刚(2009)采用同重标签相对与绝对定量(iTRAQ)标记分析了红麻不育系L23A和保持系L23B单核期花药线粒体的蛋白质组差异,共鉴定出93个显著差异的蛋白质。在所鉴定的差异蛋白中,将No.326蛋白与水稻蛋白质数库进行比对,鉴定出No.326蛋白与POLLENLESS3基因高度同源,POLLENLESS3,又名MS5基因。本研究基于从李刚研究结果,再次通过搜索比对各核酸及蛋白数据库,从水稻基因组序列里选择与红麻No.326蛋白同源性最高的水稻POLLENLESS3的3个基因进行研究,其基因登陆号分别为为Os05g43040,Os03g06970和Os09g36740。在水稻基因组数据库里有4个MS5同源基因,其功能未被注释。本研究将挑出来3个基因分别命名为OsMs5-1,OsMs5-2,OsMs5-3,并对这3个基因进行了序列分析,通过RNAi基因沉默及超量表达来研究这3个基因的功能,同时我们还克隆了红麻的MS5基因,并也作了序列分析及在水稻中超量表达,为了解决基因工程创造细胞核雄性不育系的保持问题,我们还对烟草EPSPS1进行功能研究,通过对水稻与红麻MS5基因及烟草EPSPS1的功能研究,得出如下结果：1、3个水稻基因的分离与序列分析。我们从水稻分离OsMs5-1,OsMs5-2,OsMs5-3基因全长片段,对水稻OsMs5-1,OsMs5-2,OsMs5-3基因进行生物信息学分析,3个MS5蛋白分别编码含有299、315和515个氨基酸残基的蛋白质。经Scanprosite软件分析发现,3个MS5均含有一个TPR结构域(PS50005),属TPR蛋白家族成员。序列分析显示OsMs5-1,OsMs5-2,OsMs5-3基因与拟南芥MS5基因高源同源,以上结果表明以上OsMs5-1,OsMs5-2,OsMs5-3蛋白是MS5基因的同源基因。2、为了对OsMs5-1,OsMs5-2,OsMs5-3基因进行功能分析,我们通过构建水稻OsMs5-1,OsMs5-2,OsMs5-33个基因的RNAi干扰表达载体,并以中花11为受体材料用农杆菌介导法转化水稻,分别获得转基因的阳性植株。对干扰表达转基因植株T1代以nptⅡ基因片段为探针进行Southern分析证明,获得了转基因阳性植株。对3个基因的RNAi干扰转基因水稻后代进行形态及光学显微镜和扫描电镜观察,结果显示,T0代的转基因植株表现不同程度的不育。转基因植株的花粉也不同于野生型植株花粉。3、构建水稻OsMs5-1、OsMs5-2和OsMs5-33个基因带GFP标记基因的超量表达载体,并通过农杆菌介导法转化水稻。并以粳稻中花11为受体材料,农杆菌介导法转化水稻,分子鉴定获得了阳性植株。为了对水稻OsMs5-1、OsMs5-2和OsMs5-3基因进行亚细胞定位预测,用3个带GFP的转基因植株的幼苗根尖与愈伤组织压片置于荧光显微下观察绿色荧光蛋白GFP的表达。转基因植株能观察到被蓝光激发出耀眼的绿色荧光。4、为了研究MS5同源基因在红麻(Hibiscus canabius L.)花药中的转录特征,以不育系L23A为试材,基于已知的红麻MS5基因5′端cDNA序列,采用3’RACE和RT-PCR技术对该基因全长cDNA序列进行了克隆。序列比对分析结果表明,红麻花药组织中同时存在MS5基因2种不同的转录本,其长度分别为972bp和1105bp,依次命名为HcMs5-α和HcMs5-β。这2种转录本均包含了完整且一致的编码序列(CDS),全长为858bp,预测编码的蛋白质含有285个氨基酸残基,相对分子量为32.4kD,理论等电点为7.62。两者5′端前972bp序列完全一致,但3′端的非编码区(UTR)长度有所不同,HcMs5-β在第972bp以后比HcMs5-α多出133bp的序列,具有选择性转录终止的特征。这种转录终止信号的可选择性可能与该基因转录后水平的调控有关。半定量RT-PCR分析红麻不育系和保持系MS5基因的时空表达,结果显示,MS5基因在不育系和保持系中,在各个组织的表达没有差异,其中无论是不育系和保持系,MS5基因在根、花瓣及双核期花药有表达,在茎,叶和单核期花药,MS5基因的表达量极低。但据李刚(2009)的研究,红麻该基因在蛋白水平上的表达量,在不育系和保持系之间差异显著。由此推测可能与该基因转录后水平的调控有关。对红麻HcMs5基因进行亚细胞定位预测,对GFP报告基因的转基因植株的幼苗根尖与愈伤组织压片置于荧光显微下观察绿色荧光蛋白GFP的表达。转基因植株能观察到被蓝光激发出耀眼的绿色荧光。5.EPSPS合酶(5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶)是莽草酸途径中的一个关键酶,是除草剂草甘膦的作用靶标。草甘膦通过阻止EPSPS合酶的形成而使莽草酸途径中止,从而达到对植物的灭杀作用。草甘膦是一种广谱型灭生性除草剂,植物中EPSP合成酶的过量表达或某些活性位点氨基酸的突变对高剂量的草甘膦有较强的耐受性。为了利用基因工程创造细胞核雄性不育系,对于基因工程创造细胞核雄性不育系的保持问题,我们设想以烟草TOB-EPSPSI基因作为筛选标记,筛选细胞核雄性不育后代的不育株与可育株,以解决不育系的保持问题。本研究对烟草的抗除草剂草甘膦TOB-EPSPSI基因进行了研究,将烟草的TOB-EPSPSI基因(基因登陆号M61904)构建了植物表达载体,并用农杆菌介导法导入水稻。分子鉴定证明烟草TOB-EPSPSI基因被成功整合到粳稻中花11受体材料中。对转基因植株T2代进行草甘膦抗性试验,喷施30m mol/L及35m mol/L高浓度的草甘膦发现转基因植株抗性比野生型的强。