利用酵母双杂交筛选IrrE相互作用蛋白及相关基因的研究

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在植物体中有许多转录因子参与调控植物的抗逆反应。转录因子在高等植物的生长发育以及对外界环境的应答反应起非常重要的作用。IrrE是一种来源于耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,DR)的转录因子,能增强植物的盐耐受性。为了进一步探讨IrrE基因在增强植物耐盐途径中的作用,本研究构建了诱饵载体pGBKT7-IrrE,应用酵母双杂交系统筛选与IrrE相互作用的蛋白,以期通过这一线索获得这些蛋白的功能信息,为研究IrrE参与植物耐盐的分子机制提供理论基础。   首先从PBI121载体上克隆得到IrrE基因全长,将其作为目的基因构建筛选时所用的诱饵载体pGBKT7-IrrE。并转化酵母AH109菌株,检测其对酵母细胞的毒性与自激活作用。   然后将诱饵质粒pGBKT7-IrrE和拟南芥cDNA文库质粒顺序转化酵母AH109细胞,通过QDO营养缺陷型培养基和β-半乳糖苷酶显色法筛选阳性克隆。随后将所得的1523个克隆经QDO营养缺陷型培养基多次划线分离、X—Gal显色分析、PCR检测以及酶切分析,初步得到167个阳性克隆。   再将所得候选阳性克隆的测序结果在NCBI上进行核酸和蛋白质的序列对比,得出所筛选基因的相关信息并对其进行分组和归类。   最后挑出两个与逆境胁迫应答相关的基因,即3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPB(At1g42970)和GAPC2(At1g13440),将其构建到原核表达载体pET28a(+)上,并在大肠杆菌BL21中成功表达,其蛋白分子量分别为48KD和37KD。   总之,本研究发现了可能与IrrE有相互作用的两个蛋白,对它们之间相互作用机制的进一步研究,为阐释IrrE参与植物耐盐的分子机制创造条件。
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