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目的:探索骨髓间充质干细胞成软骨细胞分化培养;构建可注射型工程化TGF-β3质粒,使其转染软骨细胞构建持续分泌表达TGF-β3蛋白,为后期靶向修复大鼠骨性关节炎软骨损伤的研究提供实验基础。方法:1.从大鼠骨髓中提取骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),用DMEM/F12培养基进行培养,传代培养进一步分离、纯化;在P3代通过抗CD29、抗CD45及抗CD90分别鉴定BMSCs表面抗原,用CCK-8法检测P3代细胞的增殖活性。取P3代第3天细胞随机分为两组:诱导组和对照组。诱导组用成软骨细胞培养液,对照组用10%血清的DMEM/F12培养液。分别于4d、7d、14d用免疫荧光细胞化学法和阿尔新蓝染色分别检测各组Ⅱ型胶原(colⅡ)和蛋白聚糖的表达。2.将人工合成基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase,MMP)互补核苷酸链插入含绿色荧光蛋白(EGFP)的pcDNA3.1(+)质粒中,重组质粒pcDNA3.1(+)-EGFP-MMP双酶切行凝胶电泳检测;用逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)分别提取大鼠前体相关蛋白(Latent Associated Protein,LAP)和活性的TGF-β3(mature Transform Growth Factor-beta 3,mTGF-β3),依次在MMP的上下游插入目的基因LAP及mTGF-β3,重组质粒pcDNA3.1(+)-EGFP-LAP-MMP和重组质粒pcDNA3.1(+)-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3依次双酶切行凝胶电泳检测;基因测序检测重组质粒pcDNA3.1(+)-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3。3.将诱导细胞随机分为三组:空质粒组、重组质粒组及空白对照组。通过脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.1(+)-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3导入细胞,倒置荧光显微镜观察其在细胞内的表达;通过Western Blot分析比较重组质粒转染组与空质粒转染组细胞内TGF-β3蛋白的表达情况。提取重组质粒转染组细胞培养液,随机分为MMP组和无MMP组,MMP组加入MMP2,无MMP组加入等量PBS,Western Blot分析2h后mTGF-β3蛋白的表达情况。结果:1.获得了大量纯化的BMSCs;BMSCs在P3代第3d具有最大对数增殖活性;从免疫荧光细胞化学法和阿尔新蓝染色均表明BMSCs向软骨细胞分化,获得了满意的软骨细胞。2.RT-PCR凝胶电泳结果示获得了和LAP与mTGF-β3大小一致的条带;获得了完整插入工程化TGF-β3基因序列的重组质粒pcDNA3.1(+)-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3;pcDNA3.1(+)-EGFP-MMP双酶切后获得和MMP大小一致的条带;重组质粒pcDNA3.1(+)-EGFP-LAP-MMP和重组质粒pcDNA3.1(+)-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3分别双酶切获得和LAP与mTGF-β3大小一致的条带;基因测序结果和GenBank上大鼠LAP与TGF-β3的基因序列符合。3.倒置荧光显微镜下可发现重组质粒pcDNA3.1(+)-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3组表达有绿色荧光蛋白的软骨细胞;Western Blot结果示重组质粒转染组细胞较空质粒转染组显著表达TGF-β3蛋白,两组比较具有统计学意义(P<0.05);Western Blot结果示MMP组的mTGF-β3蛋白表达比无MMP组高。结论:1.体外BMSCs能快速地诱导成为软骨细胞。2.成功构建了可注射型工程化TGF-β3重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-EGFPLAP-MMP-mTGF-β3。3.重组质粒pcDNA3.1(+)-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3转染软骨细胞后能高表达mTGF-β3蛋白。