目的:急性心肌梗死是心血管疾病死亡的重要原因之一,再灌注治疗是对其最好的治疗方法。即使许多再灌注的患者血液供应得到了恢复,但是心肌组织依然出现了损伤的进行性加重,这种损伤被称为缺血再灌注损伤。在缺血再灌注损伤诸多因素中,活性氧累积的氧化应激损伤是其核心。因此,通过对氧化应激损伤调控机制的探索,可以为治疗缺血再灌注损伤及其他氧化应激引起的心血管疾病提供新的策略。近年来,许多研究证实了泛素-蛋白酶体系统,尤其是E3泛素化连接酶在氧化应激损伤的调控中起到关键的作用,cul4a是近期发现的一种E3泛素化连接酶,与癌症有着密切的联系,广泛参与了细胞生理和病理过程。但是,目前尚没有研究表明cul4a是否参与到心血管系统疾病中,发挥怎样的生理功能和病理作用。因此,本研究拟应用体外心肌细胞实验,探讨cul4a在心肌细胞氧化应激损伤中的作用及分子机制。研究方法:选择H₂O₂作为H9c2心肌细胞氧化应激损伤的诱导因素,首先用50μM、100μM、200μM、400μM的H₂O₂处理2小时后,利用CCK-8-kit测定其细胞活力,使用Annexin V-FITC/PI双染色法-流式细胞术检测细胞凋亡,利用细胞免疫荧光检测氧化应激损伤后cul4a的表达水平和位置,使用western blot检测cul4a以及凋亡相关蛋白cleaved PARP-1,cleaved caspase3的表达情况,使用ROS荧光检测心肌细胞内ROS产生水平。接下来,在心肌细胞过表达cul4a,用50μM、100μM、200μM、400μM的H₂O₂处理2小时后,同样利用CCK-8-kit测定其细胞活力,使用Annexin V-FITC/PI双染色法-流式细胞术检测细胞凋亡,使用western blot检测Flag-cul4a以及凋亡相关蛋白cleaved PARP-1,cleaved caspase3的表达情况,使用ROS荧光检测心肌细胞内ROS产生水平。紧接着,利用3个cul4a-siRNA片段对心肌细胞进行RNA的干扰从而敲减蛋白,检测cul4a的敲减效率,选用敲减效率最高的片段,用50μM、100μM、200μM、400μM的H₂O₂处理2小时后,同样利用CCK-8-kit测定其细胞活力,使用Annexin V-FITC/PI双染色法-流式细胞术检测细胞凋亡,使用western blot检测Flag-cul4a以及凋亡相关蛋白cleaved PARP-1,cleaved caspase3的表达情况,使用ROS荧光检测心肌细胞内ROS产生水平。最后,利用免疫共沉淀实验检测泛素连接酶cul4a与凋亡相关蛋白PARP-1在生理状态下以及H₂O₂诱导的氧化应激损伤中内源和半外源的相互作用情况,并在梯度过表达和敲减cul4a后,检测凋亡相关蛋白PARP-1的表达水平。结果:1、H₂O₂刺激H9c2细胞后,随着浓度的逐渐增加,细胞活力显著降低,细胞凋亡比率明显增加,细胞内ROS产生增加,cul4a的表达明显上调,凋亡相关蛋白cleaved PARP-1和cleaved caspase 3表达水平显著提高。2、过表达cul4a后,200μM H₂O₂干预的过表达组细胞活力较空载对照组明显提高,细胞凋亡比率大幅下降,凋亡相关蛋白cleaved PARP-1和cleaved caspase3的表达水平显著下降,细胞内ROS产生也显著下降。3、敲减cul4a后,200μM H₂O₂干预的cul4a siRNA组细胞活力较阴性对照组明显下降,细胞凋亡比率增加大幅增加,凋亡相关蛋白cleaved PARP-1和cleaved caspase3的表达水平显著增加,细胞内ROS产生也显著增加。4、免疫共沉淀实验证实H9c2心肌细胞中cul4a可以与PARP-1相互作用,并且这种作用会在氧化应激损伤中加强。并且cul4a作为E3泛素化连接酶减少PARP-1的表达。结论:心肌细胞氧化应激损伤中,cul4a表达水平上升并且与凋亡相关蛋白PARP-1的结合增加,减少了PARP-1的表达和ROS的生成,从而抑制了细胞损伤。提示cul4a可为氧化应激导致的再灌注损伤和其他心血管疾病的提供一种新的潜在治疗策略。