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目的:卵巢癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一,死亡率居妇科恶性肿瘤的首位,成为妇科恶性肿瘤威胁最大的疾病。近年来新辅助化疗即先期化疗(neoadjuvantchemotherapy,NACT)成为一种新的治疗手段,探索先期化疗在卵巢癌化疗耐药中的作用意义重大,部分卵巢上皮性癌患者对以铂类为基础的联合化疗方案原发耐药或继发性铂类耐药,可直接影响化疗效果及患者预后。
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)是哺乳动物细胞内广泛存在的一类丝/苏氨酸蛋白激酶,与细胞增殖和凋亡密切相关。研究表明,P38MAPK受抑制是顺铂耐药的原因,但具体机制尚需探讨。
丹参酮ⅡA(TanⅡA)为中药丹参的提取物,近年研究表明,丹参酮ⅡA对多种肿瘤细胞具有细胞毒性作用,并可诱导肿瘤细胞分化和凋亡,抑制肿瘤细胞侵袭和转移,其机制可能与抑制DNA合成、调节细胞周期、影响凋亡和原癌基因的表达等有关。TanⅡA的抗肿瘤作用目前在白血病、肝癌、胃癌等临床治疗中已有应用,且表现出较好的疗效。有研究表明TanⅡA的抗肿瘤作用是通过P38MAPK信号转导通路实现的。但对于TanⅡA通过P38 MAPK逆转卵巢上皮性癌顺铂耐药的研究尚未见报道。
本实验研究P38MAPK通路在不同化疗疗程上皮性卵巢癌中的表达及其与凋亡抑制蛋白Survivin、耐药相关蛋白(切除修复交叉互补基因1(ERCC1),肺耐药相关蛋白(LRP),谷胱甘肽转移酶(GST-π))表达的相关性及与预后的关系,并探讨丹参酮ⅡA通过激活P38MAPK通路,在逆转卵巢上皮性癌顺铂化疗耐药中的作用。
方法:
1、通过免疫组化实验,检测正常卵巢组织10例,原发性卵巢上皮癌29例,经新辅助化疗后行手术的卵巢上皮性癌患者自身配对标本17对,复发性卵巢上皮癌患者30例中p-P38,Survivin及耐药蛋白ERCC1,LRP,GST的变化及其相关性,并进行随访。
2、采用顺铂不同时间、不同浓度作用于上皮性卵巢癌COC1及顺铂耐药细胞COC1/DDP细胞,Western blot方法检测P38MAPK磷酸化水平的变化。
3、MTT法检测顺铂耐药细胞COC1/DDP细胞的顺铂耐药指数,并检测P38MAPK抑制剂SB203580处理后COC1/DDP细胞的顺铂耐药指数的变化。
4、采用P38shRNA技术对COC1的P38基因进行干扰后检测其耐药指数与COC1/DDP细胞的顺铂耐药指数进行比较。
5、采用实时定量PCR技术检测COC1、COC1/DDP细胞中、用SB203580处理细胞后及P38shRNA干扰COC1细胞后,耐药蛋白ERCC1、MDR、LRP、GST-π及凋亡蛋白Caspase3、Survivin等mRNA的表达变化。
6、采用MTT的方法绘制不同剂量TanⅡA对COC1/DDP生长曲线的影响,选取合适浓度及作用时间的TanⅡA作用于COC1/DDP后检测其顺铂耐药指数的变化。
7、采用流式细胞术检测不同剂量TanⅡA作用不同时间后对COC1/DDP凋亡的影响,并检测TanⅡA、Cisplatin、SB203580及其联合用药后对COC1/DDP凋亡的影响。
8、采用Western blot方法检测不同剂量TanⅡA作用不同时间后对COC1/DDP细胞中P38及p-P38蛋白表达水平的影响,并检测TanⅡA、Cisplatin、SB203580及其联合用药后对COC1/DDP细胞中P38及P-P38蛋白表达水平的影响。
9、采用实时定量PCR的方法检测TanⅡA、Cisplatin、SB203580及其联合用药后对COC1/DDP细胞中耐药蛋白ERCC1、MDR、LRP、GST-π及凋亡蛋白Caspase3、Survivin等mRNA表达的影响。
结果:
1、p-P38在原发性卵巢癌患者中的表达与新辅助化疗术后患者中的阳性表达差异无统计学意义(P>0.05),但明显高于复发性卵巢癌组(P<0.01);Survivin、ERCC1、GST-π在原发性卵巢癌患者中的表达与新辅助化疗术后患者中的阳性表达差异无统计学意义(P>0.05),但明显低于复发性卵巢癌组(P<0.01)。
2、新辅助化疗前后的自身配对标本中p-P38、Survivin、ERCCl、LRP、GST-π蛋白的表达情况均无统计学意义(P>0.05)。
3、p-P38与Survivin、ERCC1、LRP之间存在负相关性(p<0.01),但与GST-π之间无相关性(P>0.05)。
4、p-P38阴性组平均生存时间短于阳性组平均生存时间,两组差异有统计学意义(P=0.006)。
5、在一定时间浓度梯度下,顺铂可诱导卵巢癌顺铂敏感株COC1及耐药株COC1/DDP细胞内P38MAPK的激活,但耐药株的激活程度弱于敏感株。
6、P38MAPK抑制剂SB203580及P38shRNA干扰可增加卵巢癌细胞株的耐药指数。
7、应用SB203580及P38shRNA干扰后SurvivinmRNA、ERCC1mRNA及LRPmRNA的表达明显上调。
8、TanⅡA(8μg/ml)明显降低了COC1/DDP细胞对顺铂的耐药指数(2.35±0.22),两者比较差异显著(p<0.01)。
9、TanⅡA可诱导COC1/DDP细胞凋亡,呈时间及浓度依赖性。
10、TanⅡA(8μg/ml)与顺铂(20μM)联合作用于COC1/DDP细胞后,细胞凋亡率显著高于顺铂单独作用时(p<0.01)。P38 MAPK抑制剂SB203580(10μM)可显著抑制TanⅡA引起的细胞凋亡率的升高(p<0.01)。
11、随TanⅡA作用时间的增加,p-P38蛋白的表达逐渐增强(p<0.01)。随TanⅡA作用浓度的增加,p-P38蛋白的表达也逐渐增强(p<0.01)。
12、TanⅡA(8μg/ml)与顺铂(20μM)联合作用于COC1/DDP细胞后,p-P38蛋白的表达明显强于单独用药时(p<0.01)。
13、TanⅡA(80μg/ml)作用于COC1/DDP细胞48h后,与空白对照组相比Survivin(p<0.05),ERCC1(p<0.01),LRP(p<0.01)及GST-π(p<0.01)的mRNA表达均显著下调,但Caspase3及MDR无明显变化。SB203580(10μM)可显著上调Survivin,ERCC1及LRP的mRNA的表达(p<0.01),并可显著上调TanⅡA引起的Survivin,ERCC1及LRP的mRNA表达下调(p<0.01)。TanⅡA(8μg/ml)还可以减弱顺铂引起的Survivin(p<0.05)及LRP(p<0.01)mRNA的表达上调。
结论:
1、多疗程化疗可能通过抑制P38MAPK通路而提高Survivin、ERCC1、LRP的表达导致上皮性卵巢癌铂类耐药的产生,而新辅助化疗并不能导致术后耐药机会的增加。
2、P38MAPK通路的激活可能改善铂类耐药患者的预后。
3、P38MAPK受抑制可能导致卵巢上皮性癌顺铂耐药的产生,其机制可能是通过上调了Survivin、ERCC1及LRP的mRNA表达实现的。
4、TanⅡA能够显著增强卵巢癌顺铂耐药细胞对顺铂的敏感性。
5、TanⅡA通过激活P38MAPK下调了抗凋亡蛋白Survivin,从而诱发了卵巢癌顺铂耐药细胞的凋亡。
6、TanⅡA通过激活P38MAPK下调了顺铂耐药基因ERCC1及LRP,从而降低了卵巢癌顺铂耐药细胞的顺铂耐药性。