研究目的：癌症是一种严重威胁着人类身体健康的恶性疾病,致死率高。世界卫生组织调查统计显示,癌症导致的死亡人数高居第二位,仅次于心脑血管疾病。肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,且发病率和死亡率呈逐年上升的趋势。由于饮食以及慢性肝炎等致癌风险因素,中国在肝癌防治方面临的挑战尤为严峻。目前,肝癌的诊断和治疗水平均有极大的提高,临床上的治疗手段主要有外科手术、化学治疗、放射治疗等。但是,这些治疗手段存在机体损伤大、选择性差等问题。肿瘤的基因治疗由于其针对性强、副作用小等优势,近年来受到广泛关注。寻找合适的靶点以及载体是基因治疗的关键。信号转导与转录活化因子3(STAT3)是细胞内重要的信号传递和基因表达调控因子,其靶基因包括与细胞增殖、分化、生存、恶性转化及抗凋亡调控密切相关的基因,如抗凋亡基因bcl-XL、mcl-1和细胞周期控制基因cyclin D1、 cyclin E、c-myc等；同时,STAT3也调控许多诱导肿瘤免疫耐受相关细胞因子的表达,如TGF-β、IL-10、IL-6等。在正常生理状态下,STAT3的活化是瞬时的并且受到严格的调控。然而,研究发现许多肿瘤组织中STAT3是高度表达和持续活化的,导致肿瘤细胞异常增殖；诱导肿瘤免疫耐受相关细胞因子的表达,抑制机体免疫功能,形成机体的免疫耐受状态,抵抗机体的免疫清除作用。此外,持续活化的STAT3能够上调血管内皮生长因子的表达、诱导肿瘤血管形成,从而促进肿瘤细胞的转移。因此,STAT3已成为肿瘤诊断和治疗的重要靶点。作为机体防御的重要屏障,天然免疫系统在肿瘤的免疫监视中具有重要作用。其中,作为一类独立的淋巴细胞群,NK(natural killer)细胞是天然免疫系统的重要组成部分,无需预先致敏即可识别和杀伤靶细胞,是机体抗肿瘤免疫防御的第一道防线。在肿瘤细胞发生、发展过程中,NK细胞不仅通过分泌穿孔素和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞,还可以通过分泌细胞因子调节其它免疫细胞的功能,进而在抗肿瘤免疫中发挥重要的作用。由于NK细胞的杀伤活性受到NK细胞表面受体和细胞因子等多种分子的调控,在机体免疫系统发挥抗肿瘤作用的同时,肿瘤细胞通过表达免疫抑制因子或表面配体等途经调节、抑制NK细胞的功能,并且诱导机体产生免疫抑制细胞,进一步负性调节机体的抗肿瘤免疫应答,从而造成免疫逃逸的环境。本实验室前期的研究工作证明,阻断肿瘤细胞的STAT3信号通路,可以高效抑制肿瘤细胞的体内及体外增殖。然而,肿瘤细胞内高度活化的STAT3信号通路对机体免疫应答的影响及其详细的机制尚未进行深入的研究。因此,本研究将利用分子生物学和细胞生物学技术,对肝癌细胞STAT3信号通路活化与机体抗肿瘤免疫应答之间的相互作用机制进行详细探讨。目前,阻断STAT3活性的方法主要包括干扰RNA、反义核苷酸、异位表达显性失活突变体、诱骗寡核苷酸(Decoy ODN)等。其中,STAT3Decoy ODN是人工合成与转录因子STAT3有高亲和力的双链DNA片段。通过特定的转染手段导入靶细胞,STAT3Decoy ODN作为“诱骗”顺式作用元件竞争性地与STAT3进行特异性结合,阻断STAT3进入细胞核与靶基因的顺式作用元件结合,进而抑制下游基因的表达。STAT3Decoy ODN对正常细胞毒性低、对肿瘤细胞特异性高,而且可同时抑制STAT3调控的促进肿瘤生存、促进肿瘤血管生成、促进肿瘤免疫逃逸等相关基因的表达。因此,本课题采用STAT3Decoy ODN阻断小鼠肝癌细胞STAT3信号通路,以多种小鼠荷瘤模型为研究工具,观察STAT3Decoy ODN阻断STAT3信号通路对肿瘤细胞增殖、机体抗肿瘤免疫应答以及NK细胞功能的影响,并对其机制进行了研究。在此基础上,本课题通过对荷瘤小鼠进行STAT3Decoy ODN靶向纳米粒治疗,进一步探讨阻断STAT3信号通路对肝癌治疗的可行性,为STAT3作为靶点的肿瘤基因治疗提供技术支持和理论依据。研究方法：1.体外实验：Western印迹方法检测小鼠肝癌细胞系H22与Hepal-6细胞系中STAT3的表达和磷酸化活化水平。以脂质体LipofectaminTM2000为载体将STAT3decoy ODN转染入肝癌细胞；四甲基偶氮唑蓝(MTT)方法检测阻断STAT3信号通路对肝癌细胞增殖的影响；Annexin V/PI方法检测肝癌细胞凋亡情况的变化。2.体内实验：STAT3Decoy ODN阻断小鼠肝癌细胞中STAT3信号通路,并于BALB/c小鼠腋下荷瘤,建立BALB/c小鼠荷瘤模型,观察肿瘤生长及小鼠生存期。分离荷瘤小鼠外周血淋巴细胞,流式细胞术分析NK细胞和T细胞比例以及活化水平的变化。分离荷瘤小鼠肝脏、脾脏NK细胞,MTT检测其对肝癌细胞体外杀伤功能。3.细胞清除与转输实验：通过对小鼠静脉注射anti-ASGM1抗体以及anti-CD3抗体,分别特异性清除机体内NK细胞以及T细胞,研究NK细胞以及T细胞在阻断肝癌细胞中STAT3所诱导的机体抗肿瘤免疫应答中的作用。采用磁珠分选技术分离并富集荷瘤小鼠的NK细胞,利用流式细胞技术检测分选效果；通过尾静脉注射,将不同来源的NK细胞过继转输入NOD-SCID小鼠体内,之后进行荷瘤实验,观察小鼠肿瘤生长和生存期。4.分子水平检测：实时定量PCR技术研究细胞因子IL-10、TGF-β、IFN-α IFN-β的表达水平；流式细胞技术检测NK杀伤相关配体Rael、H60和Multl的表达水平。采用ELISA实验,检测荷瘤小鼠体内抑制性细胞因子IL-10、TGF-β、以及活化性细胞因子IFN-γ表达。采用抗体中和、淋巴细胞清除等手段,研究荷瘤小鼠体内IL-10、TGF-β以及Treg细胞对NK细胞比例和活性的影响。5. STAT3Decoy ODN靶向纳米粒评价：利用合作课题组制备的肿瘤靶向纳米粒为载体,将STAT3Decoy ODN转染肿瘤细胞,利用流式细胞术、荧光显微镜检测此转染制剂转染效率,叶酸受体封闭实验考察此制剂的靶向性。分别通过尾静脉注射和瘤内注射给药,对荷瘤小鼠进行STAT3Decoy ODN的肿瘤靶向治疗。研究结果：1.肝癌细胞系H22、Hepal-6中STAT3持续高表达,STAT3decoy ODN阻断STAT3信号通路能显著性抑制肝癌细胞的增殖。2. STAT3Decoy ODN阻断H22细胞STAT3信号通路,肝癌细胞在小鼠体内的生长被显著性抑制,荷瘤小鼠的生存期明显延长；同时,我们发现小鼠体内NK细胞比例和活化水平均有显著性提高,而T细胞未发现明显变化。该结果提示,阻断STAT3信号通路,可以明显提高荷瘤小鼠体内NK细胞介导的抗肿瘤免疫应答。3.在T细胞缺陷的裸鼠荷瘤模型中,STAT3Decoy ODN处理的H22细胞的生长也得到明显抑制,且荷瘤裸鼠体内NK细胞的比例和活化水平显著提高。静脉注射anti-ASGM1抗体、anti-CD3抗体分别清除BALB/c小鼠体内的NK细胞或T细胞,结果显示,荷载STAT3Decoy ODN处理的肝癌细胞在NK细胞清除鼠体内的生长速度明显高于在T细胞清除鼠体内的生长速度。该结果提示,阻断肝癌细胞内STAT3信号通路所诱导的荷瘤小鼠体内抗肿瘤免疫应答依赖于NK细胞的功能。4.分离纯化荷瘤裸鼠体内NK细胞并过继转输入NOD-SCID小鼠体内,然后观察肝癌细胞在该鼠体内的生长情况。结果显示,来自接种STAT3信号通路阻断的H22细胞的荷瘤小鼠的NK细胞,在NOD-SCID小鼠体内具有更强的抗肿瘤活性。5.阻断STAT3信号通路,肝癌细胞H22与Hepal-6对NK细胞的杀伤敏感性显著增加；抑制性细胞因子IL-10、TGF-p的表达显著降低,活化性细胞因子IFN-α的表达明显升高；细胞表面NKG2D配体Rael、H60和Mult的表达明显升高。6.阻断肝癌细胞STAT3信号通路,荷瘤小鼠体内免疫抑制性细胞因子IL-10、TGF-β表达显著降低,免疫调节性T细胞(Treg细胞)数量明显降低,肝癌导致的机体免疫应答抑制状态得以激活。7.以叶酸受体介导pH敏感纳米粒为载体,可以将STAT3Decoy ODN高效、靶向地转运至肝癌细胞,抑制肿瘤细胞的增殖。研究结论：本课题采用STAT3Decoy ODN阻断小鼠肝癌细胞STAT3信号通路,以多种小鼠模型为研究工具,研究其对肿瘤细胞增殖以及机体抗肿瘤免疫应答的影响,特别是NK细胞功能的变化,并进一步阐述了作用机制。研究证明,STAT3decoy ODN阻断肝癌细胞中STAT3信号通路,可以抑制小鼠肝癌细胞在体内外的增殖能力,且显著延长小鼠的生存期。分析发现,荷瘤小鼠体内NK细胞的比例、活化水平以及对肿瘤细胞的杀伤能力均有显著性提高,但T细胞没有发生显著性的变化。进一步研究发现,阻断肝癌细胞中STAT3信号通路,可上调肝癌细胞表面NKG2D配体的表达,从而提高肝癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性；同时,肝癌细胞表达的免疫抑制性细胞因子IL-10、TGF-β水平下降,Treg细胞数量的降低。因此,阻断肝癌细胞中STAT3信号通路,可以打破肿瘤对小鼠免疫系统的抑制作用,逆转肿瘤的免疫耐受状态,而NK细胞功能的恢复在此过程中起关键作用；靶向STAT3可能是治疗肝癌的有效途径。研究意义：本研究首次发现阻断小鼠肝癌细胞STAT3信号通路,可以逆转荷瘤小鼠机体抗肿瘤免疫应答,特别是天然免疫系统成员NK细胞的功能；通过多种小鼠荷瘤模型及淋巴细胞清除、转输实验证明,NK细胞在阻断肝癌细胞中STAT3所诱导的机体抗肿瘤免疫应答中发挥极为重要的作用；通过抗体中和、细胞清除等手段,证明STAT3调控的免疫抑制性细胞因子以及免疫调节性T淋巴细胞在肝癌诱导肿瘤免疫抑制中发挥重要作用；通过对荷瘤小鼠进行STAT3Decoy ODN靶向治疗,验证了阻断STAT3信号通路在肝癌治疗方面的可行性。本课题为STAT3作为肝癌治疗靶点的应用提供了更为详实的实验依据和技术支持。