禽流感（AI）是由A型禽流感病毒（AIV）引起的一种严重危害家禽业和人类公共卫生安全的人兽共患病。通过疫苗接种是预防该病的重要手段,传统的流感疫苗生产采用鸡胚培养抗原,存在需要大量的鸡胚、在抗原培养过程中容易发生污染、成本高等缺陷。采用细胞悬浮培养技术不仅可以降低疫苗生产成本,还具有抗原效价高、容易大规模生产等优点。本研究拟通过MDCK细胞悬浮培养传代、筛选出H5、H7亚型禽流感疫苗种毒,获得规模化悬浮培养病毒抗原的工艺参数,制备H5、H7亚型二价灭活疫苗,并对其免疫效果进行评价。结果如下。对MDCK细胞进行无血清悬浮培养,不同时间点计算活细胞密度、细胞活力、细胞比生长速率,绘制细胞生长曲线图。发现在细胞传代后活细胞密度在96 h达到峰值,约为14.3x10~6cells/m L,之后出现细胞空泡、细胞死亡,并有不同程度的细胞碎片,活细胞密度不断下降。细胞整个生长周期内,最高细胞活力可达98%,最大比生长速率约为0.89 d-1。细胞接种病毒后,対收获的抗原液HA效价进行检测,进一步研究病毒繁殖的最佳接毒量、最适温度、最适pH、最佳收毒时间、最适胰酶浓度。结果表明,悬浮细胞密度达到2x10~6cells/m L时,MOI为0.01,培养温度为33℃、pH约为7.4、TPCK-胰酶浓度为5μg/m L、接种后72 h收获病毒液,两株病毒可达到最高HA效价,并分别以最适条件在MDCK悬浮细胞上连续传代20代,检测各代HA效价,H5亚型AIV（r D8株）在6～8 log2之间、H7亚型AIV（r GD76株）在6～9 log2之间。分别检测各代病毒滴度,r D8株最高可达6.77 log10TCID50,r GD76株可达7.24 log10TCID50。对两株病毒传代后收获的病毒液进行全基因组测序,和原代种毒进行比对可知,r D8株各基因核苷酸序列同源性99.3%以上,氨基酸序列同源性99.8%以上,HA蛋白第446位点发生突变（W446C）,NA蛋白第415位点发生突变（R415G）,其余氨基酸突变发生在PB1和PA上;r GD76株各基因核苷酸序列同源性99.0%以上,氨基酸序列同源性99.8%以上,氨基酸突变只发生在PB1和PB2上。选取两株病毒传代培养后第9代病毒液灭活制备油乳剂二价灭活疫苗,免疫3周龄SPF鸡,免疫后21 d采血检测,其中H5亚型HI抗体最高可达9 log2、几何平均值为8.0 log2,H7亚型HI抗体最高可达10 log2、几何平均值为8.4 log2。分别用H5和H7亚型疫苗效检毒株对免疫鸡进行攻毒保护试验,对照组鸡全部死亡,免疫组鸡均全部获得保护,证明本实验培养收获的抗原液制备的二价疫苗具有良好的免疫保护效果。