【摘 要】
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牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）能够引起一种极为复杂,呈多种临床症状的牛病毒性腹泻-黏膜病（Bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD-MD）,严重危害全球畜牧业的健康发展。干扰素调节因子7（IRF7）是IRF转录因子家族的主要成员,也是IFN持续反应的正反馈调节环中不能或缺的一部分。前期q RT-PCR和
【基金项目】
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西部地区高发人兽共患传染性疾病防治协同创新项目（2011协同创新项目）；
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牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）能够引起一种极为复杂,呈多种临床症状的牛病毒性腹泻-黏膜病（Bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD-MD）,严重危害全球畜牧业的健康发展。干扰素调节因子7（IRF7）是IRF转录因子家族的主要成员,也是IFN持续反应的正反馈调节环中不能或缺的一部分。前期q RT-PCR和转录组数据发现,在NCP BVDV感染的牛外周血单核淋巴细胞中IRF7呈下调表达,但是,IRF7与BVDV感染之间的关系尚不清楚。据此,本研究旨在确定牛IRF7（Bo IRF7）与BVDV复制的关系,为阐明IRF7在先天免疫抗病毒应答的分子机制中提供依据。目的:（1）利用生物信息学方法分析IRF7基因结构和功能,克隆Bo IRF7基因,利用原核表达系统表达IRF7蛋白,并制备多克隆抗体,为后续的实验研究提供物质材料。（2）构建Bo IRF7过表达和干扰细胞模型,为Bo IRF7基因功能验证奠定基础。（3）确定Bo IRF7与BVDV增殖的关系,为阐明Bo IRF7在天然免疫应答中的作用机制提供依据。方法:（1）使用生物信息学软件预测并分析Bo IRF7潜在生物学功能,参考Gen Bank已公布的IRF7基因序列,设计引物,通过RT-RCR扩增获得预期大小的目的基因,将其与p MD19-T载体进行连接后测序;为表达高效的IRF7蛋白,首先将克隆出的大小为1497bp的基因片段与带有His标签的p ET-28a载体质粒分别进行酶切后连接成为重组质粒,转化到大肠杆菌表达菌株中,挑取阳性克隆,经酶切鉴定和测序正确后诱导表达纯化,并对纯化后的蛋白进行复性,以复性后的蛋白为免疫原免疫实验兔,经三次免疫得到多克隆抗体血清,对抗体进行纯化,后用BCA法测定蛋白浓度,并用间接ELISA测定抗体效价。（2）通过构建过表达及干扰慢病毒载体,利用HEK-293T细胞包装慢病毒粒子,感染宿主细胞,经RT-PCR和Western-blot检测相关基因的过表达和干扰效果,筛选出干扰效果较好的片段。（3）通过BVDV感染细胞后,采用实时定量PCR和Western-blot方法检测Bo IRF7基因的m RNA及蛋白的表达情况;用NCP BVDV感染IRF7过表达和干扰的MDBK细胞,平行制备相同的两组样品,分别用作RT-PCR和Western-blot检测,验证其对病毒的增殖影响。结果:（1）通过对Bo IRF7进行生物信息学分析发现其具有潜在抗原潜力,筛选出抗原优势表位,成功从BVDV感染的MDBK细胞中扩增出大小为1497bp的基因片段,成功表达出60 KDa的IRF7蛋白,BCA方法测得纯化IRF7蛋白浓度为2000μg/m L;Western-blot结果显示制备的抗体具有良好特异性,间接ELISA检测出IRF7多克隆抗体的效价为1∶128000,成功制备出IRF7多克隆抗体。（2）成功构建过表达和干扰MDBK细胞系,并筛选出干扰效果较好的干扰片段。（3）BVDV病毒感染过表达及干扰的MDBK细胞系后,发现IRF7过表达后引起BVDV复制降低,干扰IRF7的表达会引起BVDV复制增强,结果表明IRF7基因的表达影响BVDV的复制。结论:（1）利用生物信息学方法预测IRF7蛋白具有良好抗原性,利用原核表达系统表达IRF7蛋白制备的多抗具有良好的特异性。（2）过表达IRF7会明显抑制BVDV的增殖,而干扰IRF7的表达则促进BVDV的增殖,IRF7在抑制BVDV增殖方面发挥重要作用。
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