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IRF-4结合蛋白IBP是新近发现与免疫突触形成、T淋巴细胞激活及Th1/Th2极化关系密切的一个新分子。IBP在造血祖细胞中高表达,但在向粒细胞,红细胞,巨噬细胞分化的过程中表达降低。通过对IBP缺失小鼠的观察,发现动物出现SLE样自身免疫反应,特征为血清IgG水平明显升高、自身抗体产生、效应T细胞和记忆T细胞积聚,证明IBP在免疫自稳中起到重要作用。有报道IBP可以和激活的Rac1一起调节细胞形态,IBP还可以同整合素一起影响细胞的分化。先前的研究证明IBP具有重要的生理功能,但IBP的功能作用还需要更多的研究来证实。IBP缺陷T细胞显示出异常的抵抗凋亡现象,但具体通过何种途径引发疾病的机制未明。异常的细胞凋亡与肿瘤的发生发展关系密切,目前对于IBP的研究主要集中于免疫系统,而IBP在肿瘤中的功能仍然未知。本研究拟制备针对IBP的高特异性抗体,揭示其在结肠癌细胞株和结肠癌临床标本中的表达模式,确定IBP与结肠癌发生发展之间的关系,为阐明IBP在人类肿瘤中的作用奠定基础。主要研究内容和结果1. IBP多克隆抗体的制备和鉴定1)根据生物信息学分析,克隆、表达并纯化IBP特异片段(aa 410-631),免疫新西兰大白兔得到兔抗人IBP抗血清。2)应用蛋白A柱将抗血清中IgG组分纯化分离出来。3)应用亲和层析技术将抗体中针对重组蛋白标签的抗体去除,得到高特异针对IBP的兔抗人多克隆抗体。4)通过ELISA,Western blotting,抗原抗体阻断实验和免疫组化等方法鉴定兔抗人IBP多克隆抗体效价和特异性,证实该抗体的高效价和高特异性。2. IBP在人结肠癌中表达模式研究1)设计针对IBP全长的引物,应用RT-PCR技术从人结肠癌细胞株SW480, SW620, HT29, LoVo等cDNA中扩增IBP,检测结肠癌细胞株中IBP的mRNA表达水平。在SW480, SW620, HT29均检测到IBP的表达。2)采用制备的抗IBP多克隆,应用WB技术检测人结肠癌细胞株SW480, SW620, HT29, LoVo中IBP表达水平,与RT-PCR结果相符,在SW480, SW620, HT29均检测到IBP的表达。3)采用制备的抗IBP多克隆,应用激光共聚焦技术检测IBP在结肠癌细胞株SW480中的定位情况,证实IBP主要表达与SW480细胞的胞浆。4)选取63例结肠癌病人癌组织和癌旁正常组织,15例结肠腺瘤组织,采用制备的抗IBP多克隆抗体,应用免疫组化技术检测正常结肠组织,结肠腺瘤组织和结肠癌组织中IBP表达水平。5)应用χ2检验统计分析IBP的表达与结肠癌的临床分期分级,结肠癌细胞分化水平,患者性别、年龄之间的关系,提示IBP的表达与结肠癌细胞分化水平,患者临床分级存在统计学差异。(p < 0.05)。综上所述,本研究采用IBP特异片段制备了高特异的兔抗人IBP多克隆抗体,应用我们制备的抗体证实了IBP在人结肠癌细胞株中的高表达,同时证实了IBP在结肠癌临床标本中的高表达。统计学分析说明IBP的表达与肿瘤细胞的分化程度及患者的临床分级均呈负相关,提示IBP在结肠癌的发生发展中起了重要作用。IBP的过度表达促进了肿瘤的发生和发展,使肿瘤向高恶性度,低分化的方向发展,提示IBP高表达的患者预后不良。IBP促进肿瘤发展的机制未明。本研究说明IBP可能是一个新的肿瘤标志物和肿瘤治疗的靶点,对于进一步研究IBP在人结肠癌和其它肿瘤中的功能作用,探讨肿瘤的发病机理和治疗策略有重要意义。