研究背景前列腺癌是发生于男性前列腺组织的一种恶性肿瘤,基因突变导致前列腺腺泡细胞增殖不受控制是其发病的主要原因。在2002年,全世界共新发前列腺癌病例679,000例,占全部新发肿瘤病例数的11.7%,在常见肿瘤中位列第5位,在男性肿瘤中位列第2位。但是前列腺癌的发病率存在显著的种族和地区差异,且与年龄呈正相关。在经济发达的国家,其前列腺癌新发病例占肿瘤新发病例的19%,而在发展中国家前列腺癌新发病例仅占5.3%。在中国,前列腺癌发病率相对较低,2002年中国前列腺癌的标化发病率为1.6/10万,美国的标化发病率为124.8/10万,远低于美国。然而近年来在我国,随着老年化进程的加快,以及肿瘤普查力度的加强和程序的完善,前列腺癌发病率和死亡率也呈逐年增高的趋势。在上海地区增长尤为显著,2000年上海地区前列腺癌发病率为12.6/1O万,而到2006年就已上升到18.8/1O万。因前列腺癌无特异性的临床症状,且病情隐匿发展,早期易被误诊为男性前列腺增生症,临床确诊时常为晚期。对于大多数的前列腺癌来说,其发展比较缓慢,但相当一部分分化比较差之前列腺癌,其细胞活跃生长,迅速进展,很快出现局部的侵袭和浸润,进一步发展会出现远处的转移,特别是骨髓和淋巴结,并扩散到全身的各个脏器,最终将导致患者死亡。尽管内分泌治疗对于大多数前列腺癌来说具有一定的疗效,能诱使肿瘤细胞发生凋亡,并使肿瘤的发展得到有效控制。但其作用仅仅是暂时性的而非一劳永逸的根治性的治疗措施。内分泌治疗前列腺癌大多会随着时间推移出现生化进展,由对内分泌治疗敏感变为不敏感,发展成为激素难治性前列腺癌(hormone refractory prostate cancer, HRPC)或激素非依赖性前列腺癌(androgen-independent prostate cancer, AIPC)。在前列腺癌内分泌治疗大约12～18个月后将会出现肿瘤的复发,最终不可避免地发展成前列腺癌细胞激素治疗抵抗。对于激素难治性前列腺癌患者目前主要给予放、化疗。但目前所使用的化疗药物价格昂贵且毒副作用很大。由于个体化差异及毒副作用的原因,放、化疗治疗效果往往不理想。目前已经证实传统的化疗和放疗并不能使晚期前列腺癌患者生存率有明显提高,其大多数的治疗作用也仅仅是缓解症状。因此从药用植物这一主要资源提取有效成分,明确其抗癌机制及药理作用,从而筛选低毒、经济的抗前列腺癌制剂以遏制前列腺癌(尤其是激素非依赖性前列腺癌)患病率的上升趋势显得尤为迫切。阿福豆苷(Afzelin)是一种在香睡莲中发现的黄酮醇糖苷,它可以通过促进细胞凋亡来抑制乳腺癌细胞的生长,同时可在RAW264.7细胞中清除超氧阴离子自由基。肌动蛋白细胞骨架在所有真核细胞中发挥着重要的生物学功能,如参与细胞框架的构成,驱使细胞运动及分裂。肿瘤细胞转移包括肌动蛋白细胞骨架的动态重组以及通过细胞外基质重构使细胞穿过组织边界,经血液及淋巴管向远处区域传播等多个过程。因此调控肌动蛋白对癌症治疗具有重大意义。Rho GTpase家族的成员如强直性肌营养不良蛋白激酶相关Cdc42结合蛋白激酶α抗体(MRCKa)是肌动蛋白细胞骨架的关键调节因子,并同多种靶蛋白精密调控细胞生长及分化。当细胞发生基因组改变或癌变时,真核细胞更容易发生不受控制的快速增殖,而这已经在前列腺癌细胞中得到证实,其机制为由MRCKα、ROCK1及ROCK2激活的LIMK1激酶水平的提高。研究发现ROCK的抑制剂在体外可以降低肿瘤细胞的侵袭能力,而在体内实验中可以阻止癌细胞的转移,包括黑色素瘤、纤维肉瘤、肝癌、乳腺癌、肺癌和前列腺癌。这些生化实体抑制剂被认为可以帮助细胞重建正常的增殖功能并且为癌症治疗提供关键的解决方案。基于此,本实验目的为观察阿福豆苷的体外抗前列腺癌活性及其对前列腺癌相关激酶的影响。目的观察Afzelin的体外抗前列腺癌活性及其对前列腺癌相关激酶的影响。方法(1)细胞培养：雄激素依赖性LNCaP细胞和雄激素非依赖性PC-3细胞系从美国菌种保藏中心(弗吉尼亚州,马纳萨斯)获得。并据其建议将LNCaP细胞培养于含10%胎牛血清,谷氨酰胺,2%青霉素-链霉素和0.2%庆大霉素的EMEM培养基中。PC-3细胞生长于含2 mM左旋谷酰胺、1.5 g/L碳酸氢钠(90%)+10%胎牛血清的Ham’s F12K培养基中。细胞在37℃含95%空气和5%二氧化碳湿润环境中培养。(2)细胞增殖实验：将对数生长期的LNCaP和PC-3细胞,接种于96孔培养板(5000个/孔),每孔100 u1。恒温箱培养24 h,使细胞贴壁。次日分别加入不同终浓度(0.1,1,10 ug/ml)的阿福豆苷。每组设4个平行孔。在CO2培养箱中再孵育,干预24 h,48 h,72 h后终止培养,0 ug/ml组仅加等量培养液。加入10 ul· WST-1标记溶液(WST-1细胞增殖试验试剂盒；罗氏诊断,印第安纳波利斯)后再放置培养箱中孵育2 h。根据厂家提供的说明书,用96孔板酶标比色计检测各孔420 nm处的吸光度值(17)。(3)细胞周期分析：将培养的LNCaP和PC-3前列腺癌细胞分别加入不同的浓度的阿福豆苷孵育24 h。粘附细胞用胰蛋白酶消化并与悬浮细胞群混合,然后离心,零度PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤3次,将一部分被洗涤的细胞染成台盼蓝以检测细胞活性。调整细胞数至1x106细胞/ml,以2：1的比例(v/v)在冷甲醇固定过夜,碘化丙啶染色。使用Becton Dickinson (San Jose, CA)流式细胞仪检测细胞周期分布,分析各个实验条件下的细胞数不少于10,000个。使用CellQuest细胞周期分析软件进行数据分析。(4)蛋白印迹分析：检测不同浓度(0.1,1及10 μg/ml)阿福豆苷对前列腺癌LNCaP和PC-3细胞中MRCKα, LIMK1及ROCK1激酶表达的影响。采用改良Lowry分光光度法测定蛋白质浓度(DC Protein Assay; Bioroad, Hercules,CA)。分解产物在7～10%的变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。我们将分解后蛋白转输至硝化纤维,用5%脱脂牛奶或3%BSA(牛血清白蛋白)封口,以1xPBS缓冲至0.1%到20%之间。MRCKα, LIMK1及ROCK1的单克隆抗体在Cell Signaling Technology (Beverly, MA)处购买,此抗体已经由制造商按照Western blotting的需求进行了适度稀释。结果(1)阿福豆苷可以降低前列腺癌细胞在体外的生长速率：此项研究分析了阿福豆苷对于PC3和LNCaP这两种前列腺癌细胞系生长的影响。在这两种前列腺癌细胞经过培养之后,细胞被暴露在浓度逐渐增大的阿福豆苷中(分别为0.1,1和10μg/ml),并通过WST-1细胞增值试验记录了之后72小时内细胞的发育能力。图2的A和B分别显示了在这72小时之内,两种前列腺癌细胞的生长速率。此外,图中也以百分比的形式显示出当天的剂量反应曲线,各测量值一式四份。从图上可以看出,浓度为1 μg/ml与10 μg/ml的阿福豆苷在所有的三个时间点上都强烈影响到了两种细胞的生长速率,而0.1 μg/ml浓度下没有明显的生长抑制作用。阿福豆苷对PC3和LNCaP这两种类型的细胞都表现出了强有力的生长抑制作用。(2)阿福豆苷诱导PC3和LNCaP细胞凋亡：流式细胞仪分析检测LNCaP和PC-3细胞在不使用以及使用阿福豆苷24小时后的细胞周期分布。从图3A可以看出,经过浓度为10μg/ml的阿福豆苷处理后的PC-3细胞中,有相当于细胞总数27.6%的一段宽峰数值出现在GO期,相比之下的对照组中数值仅为12.7%。除此之外,有43.3%的细胞达到了生长周期的G1期。这提高了停留在GO期的PC-3细胞数量。有意思的是,在LNCaP细胞中观察到了相同的结果,对照组中细胞总数的12.0%都停止在了GO期,而经过浓度为10μg/ml阿福豆苷处理的LNCaP细胞则有19.4%停止在GO期(图3B),此处也有50.7%的细胞达到了G1期。经过阿福豆苷处理后的细胞峰值停留在GO期,说明细胞正在进入大规模凋亡阶段或者毒性反应阶段。此项结果也表明,阿福豆苷对这两种细胞都有选择性作用。(3)阿福豆苷抑制三磷酸酶家族蛋白质的表达：为了观察阿福豆苷对前列腺癌细胞类型的分子影响,我们对阿福豆苷如何影响细胞周期进程和凋亡过程中某些关键分子的表达进行了重点分析。逐渐增加的阿福豆苷浓度会对三磷酸酶家族表达造成影响,如LIMK1, MRCKa和ROCK1蛋白。通过蛋白印记分析发现,当阿福豆苷的剂量增大时,LNCaP与PC-3细胞中的这些激酶的磷酸化逐渐消失(图4A)。但是通过密度测量之后显示在PC-3细胞中其抑制作用更加明显。这些激酶的磷酸化将打乱肌动蛋白细胞骨架,导致细胞快速恶性增长。结论阿福豆苷能强有力的抑制雄激素敏感性LNCaP细胞和雄激素非依赖性PC-3细胞这两种细胞的增殖,阻断细胞周期在GO期,诱导LNCaP和PC3细胞凋亡。其对这些细胞的抗癌活性与LIMK1表达抑制有关,当阿福豆苷的剂量增大时,LNCaP与PC-3细胞中的LIMK1, MRCKα和ROCK1蛋白等激酶的磷酸化逐渐消失,这也就证实了阿福豆苷反向调节LIMK1的作用是通过抑制MRCKα和ROCK1的方式来达到的,而这些激酶的磷酸化将打乱肌动蛋白细胞骨架,导致细胞快速恶性增长。阿福豆苷抗前列腺癌的体外试验结果显示,阿福豆苷能作为一种强有力的治疗前列腺癌的方法,应用前景令人鼓舞,然而,还需要进一步的动物实验来证实其抗癌潜力。创新及意义(1)首次研究证实了阿福豆苷这一从香睡莲中发现的黄酮醇糖苷可以降低前列腺癌PC3和LNCaP细胞在体外的生长速率。(2)首次研究证实了阿福豆苷可以提高停留在G0期的LNCaP细胞和PC-3细胞数量,从而促进前列腺癌PC3和LNCaP细胞凋亡。(3) 首次研究证实了阿福豆苷能抑制前列腺癌PC3和LNCaP细胞中三磷酸酶家族蛋白质的磷酸化,抑制前列腺癌PC3和LNCaP细胞快速恶性增长。(4)本研究系统证明了阿福豆苷这一从香睡莲中提取的黄酮醇糖苷是一种对激素非依赖性前列腺癌治疗有效及有前途的抗癌药物,为激素非依赖性前列腺癌的治疗提供了新的方向。