石斑鱼虹彩病毒SGIV胸苷激酶基因克隆、表达及其分子特征分析

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病毒编码的胸苷激酶(Thymidinekinase,TK)是许多大分子DNA病毒的一种特征基因,包括痘病毒(Poxvirus)和疱疹病毒(Herpesvirus)等。虽然病毒的DNA合成时通常使用宿主细胞的胸苷激酶,但有报道称病毒的胸苷激酶对于病毒的复制和激活有重要作用。石斑鱼虹彩病毒(Singaporegrouperiridovirus,SGIV)是大分子DNA病毒,双链环状DNA,基因组全长140,131bp,共有162个开放阅读框(Openreadingframe,ORF),在正反链上分别编码41-1268个氨基酸。从SGIV克隆得到ORF067全长cDNA序列,生物学信息学分析表明该ORF编码的是胸苷激酶。SGIVtk基因全长576bp,编码191个氨基酸,分子量为21.6kDa,等电点为6.25。预测有五个功能结构区,其中在N端的第11-18个氨基酸“GNIGAGKS”是TK蛋白保守的核苷酸结合区。二级结构预测SGIVTK主要以螺旋为主,包括52.63%的螺旋,9.95%折叠以及37.70%松散结构。 序列相似性分析显示SGIVTK与已报道的TK同源性较低,与蛙病毒属的同源性最高,但也只有48%,这几种蛙病毒属代表性病毒包括:Wamena虹彩病毒(Wamenairidovirus,WIV)、流行性造血器官坏死病毒(Epizootichaematopoieticnecrosisvirus,EHNV)、蛙病毒3(Frogvirus3,FV3)、饰纹汀蛙虹彩病毒(Bohleiridovirus,BIV)和虎蛙病毒(Tigerfrogvirus,TFV)。因而推测我们所分离克隆的SGIVTK基因是一个病毒新基因。系统进化分析是基于TK蛋白水平进行的,SGIV同台湾分离的石斑鱼虹彩病毒TGIV(GrouperiridovirusfromTaiwan,TGIV)同源性非常高,相似率达到99%,二者同蛙病毒属的病毒较为相近,与利用MCP进行的系统进化分析结果一致。另外,同其他病毒及细胞型TK相比较SGIVTK与细胞型TK2更为相似一些。 将SGIVtk编码区克隆到表达载体pET32a中,在大肠杆菌BL21(DE3)中超量表达出带6×His接头的融合蛋白,大小与预期分子量一致。将此蛋白免疫BALB/cA小鼠制备了多克隆抗血清。纯化融合蛋白,采用放射酶活分析法对其进行活性分析表明,原核重组表达的融合胸苷激酶具有酶活性,在N端融合部分对胸苷激酶活性没有影响。 为了进一步研究SGIVtk基因的功能,用半定量RT-PCR和实时定量RT-PCR两种方法研究了SGIV感染GP细胞后SGIVtk基因转录时相,tk的转录是从细胞感染后6h开始,随着感染时间的延长tk基因表达量升高。实验结果分析显示,SGIVtk基因是一个早期基因。利用绿色荧光蛋白GFP报告基因构建了重组质粒pGFP-TK,将其转染GP细胞,转染24h后观察显示融合蛋白GFP-TK分布在细胞质中,初步推断SGIVTK蛋白定位于感染细胞的细胞质中。
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