背景与目的肺癌是我国近年来发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,并以每年2-5%的速度提高,约占据恶性肿瘤总数的四分之一左右。肺癌组织学上分为小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC),及非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),非小细胞肺癌病理分为鳞状细胞癌、腺癌、大细胞未分化癌等类型,约占肺癌总数的80.4%。肺癌早期症状不明显,约70%的患者就诊时已发生转移,错失手术时机,因此肺癌治疗的手段主要是化疗、放疗、靶向治疗及生物免疫治疗等。尽管分子靶向药物对肺癌优势人群疗效显著但其适用范围较为狭窄,化疗仍在非小细胞肺癌治疗中最为普遍。目前,化疗失败的关键因素在于化疗药物耐受。研究化疗耐药的发生机制、检测手段及耐药逆转等方面,对非小细胞肺癌治疗有重要意义,可以为非小细胞肺癌临床治疗提供新的思路。Aurora-A激酶是丝氨酸/苏氨酸蛋白质家族成员,参与调控细胞有丝分裂的许多过程,比如中心体突变和分离,纺锤体组装和维持,染色体配对等等。Aurora-A的表达和活化主要发生在细胞有丝分裂G2晚期至M期的过程中,其亚细胞定位在细胞周期循环中发生动态变化。Aurora-A的基因表达和蛋白水平在诸如肺腺癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌等许多恶性肿瘤中异常提高,我们实验室已经证实Aurora-A激酶可以通过调控NF-kB/miRNA-21/PTEN信号通路,促进原发性肝癌细胞发生耐药。此外,在实验室既往的基础研究中已经完成了人肺腺癌耐药细胞株SPCA1/DTX的建立。以药物浓度递增法培养的SPCA1/DTX耐药株可耐受稳定浓度的多西他赛,SPCA1/DTX耐药株较SPCA1亲本株中Aurora-A的表达水平亦有明显升高,我们推测其在肺腺癌耐药的发生发展过程中也可能发挥着重要的作用。Aurora-A的表达水平受多种因素调节,表观遗传学失控是Aurora-A基因在肺腺癌细胞中表达水平升高的重要原因。MicroRNA(miRNA)可以抑制靶基因转录后的翻译,调控基因表达,对不同的分子信号通路产生影响,实现细胞生长、凋亡、肿瘤转移及细胞恶性表型等多方面的调控。我们预测可以调控Aurora-A表达的miRNA时发现:miRNA-885-3p是Aurora-A潜在的上游调控基因。miR-885-3p是由miR-885的3’端剪接而成的,定位于3号染色体短臂上,研究表明它还参与肺腺癌、结肠癌、鳞状细胞癌等多种肿瘤生物学行为的调控。其中,miR-885-3p可调控鳞状细胞癌的增殖和凋亡过程,并可影响鳞状细胞癌对铂类药物的化疗敏感性。在SPCA1/DTX耐药株中,miRNA-885-3p的表达水平较亲本株明显降低,我们推测miRNA-885-3p通过调控Aurora-A的表达可以影响肺腺癌的化疗敏感性。因此,本课题组构建了肺腺癌耐药株模型,探究Aurora-A及miR-885-3p在细胞增殖、凋亡等方面的作用,进而探讨其调控人肺腺癌细胞多西他赛耐药的分子机制。本研究有助于揭示肺腺癌化疗耐药的可能机制,为肺腺癌病人的临床治疗提供新的思路。材料与方法1.MTT法测定人肺腺癌多西他赛耐药SPC-A1/DTX细胞及其亲本株SPC-A1细胞、H1299/DTX细胞及其亲本株H1299细胞对多西他赛化疗敏感性的差异;以克隆形成实验检测并对比其体外增殖能力;Real time PCR检测耐药株与亲本株之间Aurora-A,miR-885-3p表达水平差异。2.使用多西他赛耐药细胞株SPC-Al/DTX和H1299/DTX及其亲本细胞株SPC-Al和H1299为研究对象,构建Aurora-A短发夹干扰RNA(shRNA/Aurora)和过表达质粒(pMDl8/Aurora),转染处理人肺腺癌SPC-A1细胞及其耐药株、H1299细胞及其耐药株,对细胞内Aurora-A基因水平进行调控,MTT法测定并比较耐药株与亲本株对多西他赛的化疗敏感性;通过克隆形成实验检测细胞体外增殖能力;流式细胞术对比检测细胞周期和细胞凋亡率;Western blot检测细胞增殖凋亡相关蛋白表达。3.通过 miRNA 靶基因在线分析软件:①TargetScanHuman6.0(http://www.targetscan.org/)、②Microrna.org(http://www.microrna.org/microrna/home.do),以生物信息学预测分析 Aurora-A基因的可能上游调控miRNA,以双荧光素酶报告基因实验检验软件预测的miRNA的正确性。4.根据生物信息学预测和双荧光素酶报告基因实验结果,确定miR-885-3p是Aurora-A的上游调控基因,合成miRNA模拟物(miR-885-3p-mimics)和单链抑制物(miR-885-3p-inhibitor),分别转染人肺腺癌SPC-Al细胞及其耐药株、H1299细胞及其耐药株,调控细胞内miR-885-3p表达水平,MTT法测定耐药株与亲本株对多西他赛敏感性;克隆形成实验检测细胞体外增殖能力差异;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot检测细胞增殖凋亡相关蛋白表达。5.以合成的 miRNA 模拟物(miR-885-3p-mimics)和单链抑制物(miR-885-3p-inhibitor)分别转染人肺腺癌SPC-A1细胞及其耐药株、H1299细胞及其耐药株,对miR-885-3p表达水平进行调控。通过合成Aurora-A短发夹干扰RNA(shRNA/Aurora)或过表达Aurora-A质粒(pMD18/Aurora)转染处理人肺腺癌SPC-A1细胞及其耐药株、H1299细胞及其耐药株,调控细胞内Aurora-A表达水平,进行拯救实验,分别以MTT法,克隆形成实验,Western blot实验检测对比多西他赛化疗敏感性,细胞体外增殖能力,细胞增殖凋亡相关蛋白表达。6.通过合成 miRNA 模拟物(miR-885-3p-mimics)和单链抑制物(miR-885-3p inhibitor)并分别转染人肺腺癌SPC-A1细胞及其耐药株、H1299细胞及其耐药株,调控细胞内miR-885-3p表达水平。通过合成Aurora-A短发夹RNA(shRNA/Aurora)转染或过表达Aurora-A质粒转染处理人肺腺癌SPC-A1细胞及其耐药株、H1299细胞及其耐药株,调控细胞内Aurora-A表达水平,进行拯救实验,以细胞划痕试验,Transwell实验检测细胞迁移能力,Western blot实验检测上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关标志蛋白表达。结果1.与亲本SPC-Al细胞相比SPC-Al/DTX细胞对多西他赛的化疗耐受能力明显增强,细胞体外增殖能力较亲本SPC-A1细胞明显升高(p<0.05),SPC-Al/DTX,H1299/DTX细胞中Aurora-A表达水平较亲本株明显升高,miR-885-3p表达水平则明显降低。2.抑制SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞中Aurora-A的表达,可提高多西他赛的化疗敏感性(p<0.05);可抑制肿瘤细胞的体外增殖能力(p<0.05);促进细胞凋亡(p<0.05);阻滞细胞周期于G2/M期(p<0.05),细胞凋亡相关蛋白A-caspase-3、Bax表达增加,Bcl2表达下降,NF-kB蛋白表达下降。反之,上调SPC-Al和H1299细胞中Aurora-A表达水平,则肿瘤细胞对多西他赛化疗的耐受能力明显增强(p<0.05);体外增殖能力明显增强(p<0.05)。3.上调SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞中miR-885-3p表达水平可增加肺腺癌细胞对多西他赛的化疗敏感性(p<0.05);降低肿瘤细胞的体外增殖能力(p<0.05):促进细胞凋亡(p<0.05);诱导细胞凋亡相关蛋白A-caspase-3、Bax表达增加,Bcl2表达下降,NF-kB蛋白表达下降。反之,下调SPC-Al和H1299细胞中miR-885-3p表达水平,肺腺癌细胞对多西他赛耐受能力明显增强(p<0.05);体外增殖能力明显增强(p<0.05)。4.软件预测及双荧光素酶报告试验均证实miR-885-3p是Aurora-A的上游调控基因,miR-885-3p的表达水平与Aurora-A表达水平负相关。SPC-A1/DTX、H1299/DTX细胞中miR-885-3p表达下调,Aurora-A表达异常升高。上调miR-885-3p表达水平可以逆转Aurora-A对细胞化疗敏感性,体外增殖能力,细胞凋亡等方面的作用。5.在SPC-Al/DTX和H1299/DTX细胞中,miR-885-3p表达下调,Aurora-A表达异常升高。耐药细胞迁移能力增加、E-cadherin表达下降、Vimentin表达升高、肺腺癌细胞耐药株发生EMT。在SPC-Al/DTX细胞中,上调miR-885-3p表达水平或下调Aurora-A表达水平后细胞迁移能力下降(p<0.05),EMT标志蛋白E-cadherin表达上升、Vimentin表达下降。结论与意义1.肺腺癌耐药细胞株中,Aurora-A表达水平较亲本株明显升高。Aurora-A高表达可增强肺腺癌细胞多西他赛化疗耐受能力,提高细胞增殖能力、抑制细胞凋亡。Aurora-A表达水平下调可诱导细胞周期阻滞于G2/M期。2.肺腺癌耐药细胞株中,miR-885-3p表达水平较亲本株明显降低。miR-885-3p高表达可提高肺腺癌细胞对多西他赛化疗的敏感性,抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。3.MiR-885-3p高表达提高肺腺癌细胞多西他赛化疗增敏性可能是通过对Aurora-A的负性调控,影响细胞增殖、凋亡而实现的。4.MiR-885-3p高表达可抑制肺腺癌细胞发生EMT,而Aurora-A高表达可促进肺腺癌细胞EMT的发生。5.本研究探讨了 miR-885-3p/Aurora-A功能轴在人肺腺癌中的异常表达及其与多西他赛化疗敏感性的关系,并初步阐释了 miR-885-3p表达异常与肺腺癌细胞EMT的相关性。提示miR-885-3p可能成为逆转肺腺癌化疗耐药的一个新靶点。