脑中风学名脑卒中,是严重危害人类健康和生命安全的常见难治疾病,具有发病率高、致残率高、复发率高、死亡率高、预后差、经济负担重的特点,在严重影响患者本人生活质量的同时,也给家庭、社会带来了沉重的负担。葛根为治疗脑中风的常用中药。目前,其主要成份葛根素已有4种相关静脉注射制剂上市,在治疗缺血性脑血管疾病方面疗效确切。葛根素作用机制与扩张脑血管、清除自由基、抗氧化、抑制炎症反应等作用有关。同时,现代药理研究亦表明,除葛根素外,葛根总黄酮中其余成分同样具有脑保护作用,能够明显缩小大脑中动脉栓塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型大鼠脑梗死体积、降低脑水肿程度、提高超氧化物歧化酶的活性、降低丙二醛水平,目前已有葛酮通络胶囊及愈风宁心系列口服制剂上市。然而,上述制剂均存在一定的缺陷。葛根素注射剂自1993年上市以来,临床不良反应时有发生,严重者甚至导致死亡;而口服制剂存在吸收差、生物利用度低的问题,并且对于中风病人而言,吞服困难,给药顺应性较差。这些问题均限制了上述制剂在临床中的应用。传统中医学理论和现代医学研究均证明鼻腔给药是治疗脑病的有效途径。因此,本课题基于“鼻通脑络”中医理论,在前期研究的基础上,选择鼻腔作为给药途径,采用微透析取样技术,对葛根素及自制葛根总黄酮经不同途径给药后的药动学差异进行了研究。具体研究内容如下:1葛根总黄酮的提取纯化工艺研究以葛根素和总黄酮提取率为指标,通过正交试验对葛根总黄酮的提取工艺进行了研究,最优工艺为12倍量水,提取3次,每次1.5h,所得工艺便捷可行,目标成分提取率达到90%以上。对葛根水提液进行了醇沉处理,最佳醇沉工艺为提取液浓缩至0.5g药材/ml,加95%乙醇,调节醇浓度为60%,醇沉24h,进一步提高了浸膏中目标成分的纯度。在此基础上,运用单因素考察法对大孔吸附树脂纯化工艺进行了优化,最佳树脂为HPD200A,上样液浓度为0.25g药材/ml,大孔树脂柱径高比为1:5,上样量为0.5g药材/ml树脂,上样流速为1ml/min,水洗2BV,水洗流速为0.5ml/min,30%乙醇洗脱4BV,醇洗流速为0.5ml/min。最终产物的出膏率约为10%,葛根素的纯度在30%以上,总黄酮的纯度在70%以上。对葛根总黄酮的树脂纯化工艺进行放大实验研究,所得提取物纯度基本稳定,工艺可行。对提取物中各成分进行质谱分析,初步推断其中5种主要成分分别为:3’-羟基葛根素、葛根素、葛根素木糖苷、3’-甲氧基葛根素、大豆苷。以Bcl-2 mRNA为指标对葛根素及提取物的抗凋亡作用进行了比较,实验结果显示,提取物组效果更好,提示提取物中有成份能够促进抗凋亡基因Bcl-2mRNA的高表达,更有助于抑制细胞在缺氧环境下的凋亡。2葛根素微透析及HPLC-MS/MS方法的建立体外透析实验及反渗透实验显示,葛根素的探针传递率及回收率分别为:63.37%和71.52%,两者之间存在显著差异,而不同浓度药液对探针回收率(或传递率)并无影响,通过探针清除率实验,证实了葛根素与探针膜材料之间不存在吸附;同时研究表明,药物回收率、传递率以及两者之间的差值会随着探针外药液搅拌速度的升高而增加;在灌流液中添加适当的添加剂能够有效的提高回收率,降低传递率,同时亦使两者之间的差异增大;随着探针膜长的增加,药物的传递率及回收率均有显著提高,但两者之间的差值亦随之而增大。上述结果提示,如果需要求得体内的真实药物浓度,以探针的在体传递率替代在体回收率是不可行的,故采用零净通量法对探针的在体回收率进行了计算。脑探针的定位按照大鼠脑立体定位图谱结合脑组织切片,确定嗅球的位置为以前囟为基点,AP:+8mm,ML:±1mm处定位,血液探针沿向心室方向植入颈静脉,以生理盐水为灌流液,采用零净通量法测定探针在血液及嗅球部位的在体回收率,分别为:17.52%,29.13%。建立了透析液中葛根素及内标柚皮苷的HPLC-MS/MS测定方法。色谱条件为C18色谱柱(Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 column(3.5μm,4.6 × 1Omm,USA));HPLC条件:甲醇-水,0-8min,24:76,8-15min,60:40;MS/MS条件:离子源:ESI负离子模式,监测离子:415/295(葛根素),579/271(柚皮苷)。葛根素在0.002-0.111 μg/mL和0.111-8.9 μg/mL范围内线性关系良好。回归方程分别为y=0.23816x-0.0001(r=0.998)和y=0.25562x-0.01582(r=0.999)。精密度、稳定性均符合要求。定量限以标准曲线最低点计。3葛根素经不同途径给药大鼠体内药动学研究以雄性SD大鼠为实验动物,将血液探针埋植于颈静脉,脑探针埋植于嗅球部位,葛根素按照7mg/kg的剂量分别静脉推注、静脉滴注、鼻腔给药,微透析取样,20min收集样品一次,HPLC-MS/MS检测透析液中药物浓度。以Kinetica药动学软件非房室模型处理体内数据。血药动力学结果显示:各组的血药峰浓度Cmax分别为30.89±10.69μg/ml(i.v.)、9.31±3.99μg/ml(i.v.gtt)、3.82±1.03 μg/ml(i.n.),各组的血药 AUC0-5h 分别为 1524.63±584.05μg/ml.min(i.v.)、1037.18±501.70 μg/ml·min(i.v.gtt)、623.12±170.86 μg/ml.min(i.n.),各组的 tmax分别为 20min(i.v.)、100min(i.v.gtt)、68±10.95min(i.n.),各组的平均滞留时间分别为 44.20±8.97min(i.v.)、87.24±7.84min(i.v.gtt)、140.27±7.86min(i.n.)。与静脉给药相比,鼻腔给药组各参数均有显著性差异。嗅球部位药动学结果显示:各组的药物峰浓度Cmax分别为0.29±0.07μg/ml(i.v.)、0.0523μg/ml(i.v.gtt)、0.50±0.16μg/ml(i.n.),各组的嗅球部位 AUC0-5h 分别为 28.44 ±6.89μg/ml·min(i.v.)、8.30±4.85μg/ml·min(i.v.gtt)、86.84±23.50μg/ml.min(i.n.),各组的 tmax分别为 20min(i.v.)、132±36min(i.v.gtt)、212±30.33 min(i.n.),各组的平均滞留时间分别为 81.76±11.46min(i.v.)、162.63±19.00min(i.v.gtt)、186.43±6.25min(i.n.)。各组的脑靶向指数分别为1.87%、0.80%、13.94%。鼻腔给药虽然血药浓度较低,但嗅球部位药物浓度得到了很大的提高,脑靶向性显著提高。4葛根素经不同途径给药MCAO模型大鼠体内药动学研究为了进一步模拟葛根素的临床用药对象和给药方式,以雄性SD大鼠为实验动物,制备大鼠大脑中动脉栓塞模型,对病理状态下,葛根素经不同途径给药后的药动学行为进行了研究。血药动力学结果表明:各组的血药峰浓度Cmax为13.84±2.45μg/ml(i.v.gtt)、4.36±1.06μg/ml(i.n.),各组的血药 AUC0-5h分别为 1416.68±249.74μg/ml·min(i.v.gtt)、533.48±136.75μg/ml·min(i.n.),各组的 tmax分别为 100 min(i.v.gtt)、80±31min(i.n.),各组的平均滞留时间分别为88.85±6.34 min(i.v.gtt)、115.61±13.82min(i.n.)。鼻腔给药的绝对生物利用度为37.66%,与正常大鼠相比,静脉滴注时MCAO模型大鼠具有较高的血药AUC,鼻腔给药时MCAO模型大鼠血药AUC与正常大鼠组无显著性差异。嗅球部位药动学结果表明:各组的药物峰浓度Cmax为0.19±0.12μg/ml(i.v.gtt)、1.54±0.43μg/ml(i.n.),各组的嗅球部位的 AUC0-5h 分别为 24.50±16.74μg/ml·min(i.v.gtt)、255.96±87.74μg/ml·min(i.n.),各组的 tmax 分别为 104±38 min(i.v.gtt)、92±11min(i.n.),各组的平均滞留时间分别为141.72±12.68 min(i.v.gtt)、136.57±17.12min(i.n.),各组的脑靶向指数为1.73%和47.98%。鼻腔给药组的Cmax、AUC均显著高于静脉滴注组,脑靶向系数更是高达静脉滴注组的27倍,充分体现了鼻腔给药的优越性。与正常大鼠相比,静脉滴注和鼻腔给药时,MCAO大鼠嗅球部位药物峰浓度和AUC显著增加,并且曲线形态发生明显变化,这种现象可能是由于血脑屏障的破坏或脑缺血对嗅黏膜和嗅神经的影响所导致的。5葛根总黄酮经不同途径给药MCAO模型大鼠体内药动学研究以雄性SD大鼠为实验动物,制备MCAO模型大鼠,自制葛根提取物按照20mg/kg的剂量分别静脉滴注、鼻腔给药,微透析取样,HPLC-MS/MS检测透析液中药物浓度。以Kinetica药动学软件非房室模型处理体内数据。血药动力学结果表明:各组的血药峰浓度Cmax为14.96±3.97μg/ml(i.v.gtt)、0.75±0.30μg/ml(i.n.),各组的血药 AUC0-5h 分别为 1707.02±457.88μg/ml·min(i.v.gtt)、134.72±37.61μg/ml.min(i.n.),各组的 tmax 分别为 104±9 min(i.v.gtt)、68±18min(i.n.),各组的平均滞留时间分别为90.28±15.18 min(i.v.gtt)、139.41±12.11min(i.n.),鼻腔给药的绝对生物利用度为7.89%,但药物在血浆中的MRT显著长于静脉滴注组。与葛根素单独给药相比,静脉滴注时两者血药AUC并无显著差异,提示在该药物浓度下提取物中其余黄酮类成分并未对葛根素的代谢产生影响;但鼻腔给药时提取物组的血药AUC显著降低,仅为葛根素组的25%,这种现象可能是由于提取物中多种成分在透过鼻黏膜时发生竞争所致。嗅球部位药动学结果表明:各组的药物峰浓度Cmax为0.060±0.03μg/ml(i.v.gtt)、0.37±0.11μg/ml(i.n.),嗅球部位的 AUC0-5h分别为 7.38±4.65μg/ml-min(i.v.gtt)、58.60±14.48μg/ml·min(i.n.),鼻腔给药组嗅球部位药物浓度持续升高,并且下降趋势不明显,各组的DTI分别为:0.43%和43.50%。与葛根素单独给药相比,静脉滴注时提取物组嗅球部位AUC仅为葛根素组的30%,这可能是由于透过血脑屏障时黄酮类成分发生竞争所致,鼻腔给药也发生相似的现象。尽管葛根素组和提取物组鼻腔给药后血液和嗅球部位AUC存在显著差异,但二者的DTI分别为47.98%和43.50%,较为接近,进一步证明了黄酮类成分在经鼻转运入脑过程中存在竞争。