研究背景长期吸烟患者骨折后延迟愈合和骨不连的发生率升高,由于致病机制不明确,目前缺乏有效的针对性的干预方法。长期吸烟所致骨折愈合不良与全身多器官系统的改变相关,想要系统地阐释这种复杂的关系网非常困难。在骨折局部,自然的骨折愈合过程中的细胞学、分子学特点已经获得了较深入的认识,而在长期吸烟作用下,骨折愈合过程的生物学变化有待进一步研究。研究表明长期吸烟对骨折愈合的不利影响早在软骨形成阶段即有表现,骨折愈合早期局部的细胞学和分子学改变可能是长期吸烟导致骨折愈合不良的重要机制。因此,本研究拟(1)构建贴近长期吸烟者骨折愈合表型的小鼠模型,(2)在该模型上研究长期吸烟作用下骨折愈合早期的关键细胞学和分子学特点,(3)基于细胞学和分子学特点探索长期吸烟所致骨折愈合不良的分子生物学机制并采用动物实验进行验证,为未来的临床干预治疗以减轻甚至防止长期吸烟所致骨折愈合不良提供可能的新靶点。研究方法一、构建长期吸烟所致骨折愈合不良小鼠模型1、将C57BL/6J、129X1/Sv J和BALB/c J三种小鼠每种品系分为吸烟组(CS)和对照组(NS),采用烟雾暴露装置对吸烟组小鼠进行香烟烟雾暴露,具体为:每只小鼠每天接受2支3R4F研究型香烟暴露,每日上、下午各对小鼠进行香烟烟雾暴露一次,间隔6小时,每周暴露6天,持续3个月。对对照组小鼠采用同样的方法进行空气暴露。通过分析烟雾暴露后小鼠体重变化、静脉血白细胞数目变化、血浆可替宁浓度和系统性炎症因子的变化来评估模拟长期吸烟的有效性。2、在香烟烟雾/空气暴露3个月的小鼠上制作股骨中段横形骨折并给予髓内固定,术后继续暴露4周后对骨折的股骨进行取材并进行X线、Micro-CT和生物力学对骨折愈合情况进行分析,挑选骨折愈合情况最接近长期吸烟者骨折愈合表型的小鼠品系用于后续研究中构建长期吸烟所致骨折愈合不良小鼠模型。二、探索长期吸烟作用下骨折愈合早期的细胞学和分子学特点1、对吸烟组和对照组股骨骨折术后7天的骨痂进行H&E和番红O染色,观察骨痂和软骨的形成情况。2、采用流式细胞术对吸烟组和对照组完整股骨、骨折术后3天、7天骨痂内小鼠骨骼干细胞(SSC(CD45-Ter-119-Tie2-Alpha V+Thy-6C3-CD105-))及其下游的骨、软骨、基质细胞的祖细胞(BCSP(CD45-TER119-Tie2-Alpha V+Thy-6C3-CD105+))进行检测分析。3、采用多重免疫荧光染色对吸烟组和对照组骨折术后7天的骨痂进行Ki67和CD105染色,观察骨痂内荧光共表达(增殖的BCSP)情况。4、Brd U标记小鼠,流式细胞学方法对不同组小鼠骨折术后3天骨痂内的SSC增殖活动进行分析。5、CCK-8方法体外检测不同组小鼠股骨来源的SSC的增殖能力。6、长期吸烟作用下骨折早期血肿环境特点:收集吸烟组和对照组骨折术后6h和24h的血肿,采用基于Luminex微球的多重细胞因子分析技术对血肿内的32种标志性炎症因子的浓度进行检测;并采用流式细胞术对骨折术后6h血肿内的主要免疫细胞(中性粒细胞(Ly-6G+,F4-80-)、巨噬细胞(Ly-6G-,F4-80+)、B细胞(CD3-,CD19+)和T细胞(CD3+,CD19+))进行检测分析。7、正常组小鼠血肿环境(NS-Hematoma)和吸烟组小鼠血肿环境(CS-Hematoma)对SSC增殖能力的影响:体外CCK-8检测不同培养环境下SSC增殖情况。三、长期吸烟抑制骨折早期骨骼干细胞增殖的分子机制研究1、IL-6 Trans信号通路对SSC增殖的调节作用:使用sgp130Fc选择性抑制IL-6Trans信号通路后CCK-8法检测SSC增殖能力变化。2、STAT3基因对SSC增殖活动的调控:(1)RT-PCR检测吸烟组与对照组小鼠骨折术后3天骨痂内SSC中STAT3的表达水平。(2)RT-PCR检测正常小鼠股骨来源SSC在体外NS-Hematoma和CS-Hematoma培养后STAT3的表达水平。(3)使用AG490对STAT3特异性抑制后,CCK-8法检测SSC体外增殖能力变化。3、IL-6 Trans信号通路对STAT3基因的调控作用:使用sgp130Fc选择性抑制IL-6 Trans信号通路后RP-PCR检测SSC中STAT3基因的表达变化。4、构建长期吸烟组(CS)、对照组(NS)、吸烟+干预组(CS+sgp130Fc)骨折小鼠模型,CS+sgp130Fc组小鼠骨折术后30分钟和48小时分别给予sgp130Fc腹腔内注射以选择性抑制IL-6 Trans信号通路,其余组注射等量Ig G抗体作为对照。5、不同组小鼠术后4周骨折愈合情况评价分析:X线、Micro-CT和生物力学分析。6、不同组小鼠骨折术后7天的骨痂进行番红O染色,观察骨痂和软骨的形成情况。7、采用流式细胞术对不同组小鼠骨折术后3天、7天骨痂内SSC和BCSP的数量进行检测。Brd U标记小鼠,流式细胞学方法对不同组小鼠骨折术后3天骨痂内的SSC增殖活动进行分析。8、流式细胞术分离获得不同组小鼠骨折术后3天骨痂内SSC,RT-PCR检测STAT3的表达水平。研究结果一、129X1/Sv J小鼠在长期烟雾暴露后的骨折愈合表型较贴近临床长期吸烟者1、吸烟组小鼠体重明显低于同期对照组小鼠,该现象在C57BL/6J和129X1/Sv J较显著;吸烟组小鼠血常规分析表明白细胞数量明显升高;吸烟组小鼠血浆可替宁浓度明显升高,CRP浓度无明显变化,大量促炎因子浓度升高或趋向升高,系统性炎症反应增强;该模型与长期吸烟者的临床特征具有相似性。2、典型X线图像显示129X1/Sv J的吸烟组小鼠样本中,骨痂量少、桥接较差,且骨折线清晰;RUST评分发现129X1/Sv J小鼠吸烟组评分明显低于对照组。Micro-CT图像显示吸烟组骨折端存在广泛的松质骨,而对照组骨折端主要为紧实的密质骨,BMD明显下降,三种品系小鼠的吸烟组较对照组均表现出明显的骨痂重塑延迟。生物力学特性分析表明三种品系小鼠吸烟组在抗弯强度和抗扭强度上均弱于对照组,而最大扭矩上只有129X1/Sv J表现出显著的下降。二、长期吸烟导致骨折术后早期炎症反应增强,抑制SSC/BCSP扩增,破坏软骨形成1、骨折术后7天的骨痂H&E显示吸烟组与对照组的骨痂面积并无明显差异,而番红O染色表明吸烟组软骨骨痂的面积及其在骨痂的百分比均明显下降。2、吸烟组小鼠术后7天骨痂内SSC和BCSP的数量均显著少于对照组。3、多重免疫荧光染色结果表明,吸烟组样本骨痂内共表达荧光(Ki67+CD105+)的面积占骨痂面积的百分比明显低于对照组,说明吸烟组样本较对照组样本骨痂内处于增殖状态的BCSP细胞数目明显减少。4、吸烟组小鼠骨折术后3天骨痂内SSC增殖受到明显抑制。5、分离自吸烟组和对照组小鼠完整股骨的SSC在体外增殖能力上无明显差异。6、对吸烟组和对照组骨愈合早期血肿内32种炎症因子的浓度分析发现,在两个时间点,吸烟组小鼠相比于其对照组均出现大量促炎因子的浓度上升,少量抗炎因子的浓度出现下降。在术后6小时吸烟组中趋化因子MIP-1α、MIP-1β、MIP-2、MCP-1、RANTES、KC、LIX和细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-2、IL6、IL-9、IL-15、TNF-α的浓度明显上升,细胞因子VEGF-A和G-CSF的浓度明显下降;在术后24小时吸烟组中趋化因子MIP-1α、MIP-2、MCP-1、KC、IP-10、LIX和细胞因子IL-1α、IL-6、IL9、IL-12p40、IL-15、IFN-γ的浓度明显上升,趋化因子G-CSF和细胞因子LIF、VEGF-A及IL-13的浓度明显下降。对骨折术后6小时血肿内的免疫细胞分析显示,吸烟组小鼠较对照组小鼠骨折术后6小时血肿样本内的主要变化为中性粒细胞、巨噬细胞、B细胞和T细胞的数量显著升高,且中性粒细胞、B细胞和T细胞的比例显著升高,而单核细胞的比例下降。7、培养于CS-Hematoma环境中的SSC增殖活动弱于培养于NS-Hematoma环境中的SSC。三、IL-6 Trans信号通路激活,上调STAT3是长期吸烟抑制骨折早期骨骼干细胞增殖的分子机制1、IL-6 Trans信号通路对SSC增殖具有调控作用:IL-6 Trans信号通路选择性抑制改善了SSC体外增殖潜能。2、STAT3基因对SSC增殖具有调控作用:(1)吸烟组小鼠骨折术后3天骨痂内SSC中STAT3的表达水平显著高于对照组。(2)相比于培养于NS-Hematoma环境中,培养于CS-Hematoma环境的SSC中的STAT3基因的表达明显升高。(3)STAT3特异性抑制后,SSC体外增殖能力明显升高,表明STAT3的表达对SSC的增殖具有调控作用。3、IL-6 Trans信号通路能调控STAT3的表达:在选择性抑制IL-6 Trans信号通路后,同样培养于CS-Hematoma环境的SSC中STAT3基因表达出现显著下降。4、IL-6 Trans信号通路选择性抑制能改善因长期吸烟所致的骨折愈合不良:X线显示,CS+sgp130Fc组有明显骨痂生成与桥接、骨折线较模糊,RUST评分较CS组显著提高;Micro-CT显示,CS+sgp130Fc组比CS组骨折周围松质骨痂体积少,骨痂内骨小梁数目较吸烟组少,且结构更有序,骨折愈合进程明显加快。生物力学显示,CS+sgp130Fc组较CS组抗弯强度、抗扭强度及最大扭矩均显著升高。5、CS+sgp130Fc组样本新生软骨面积和新生软骨占骨痂总面积的百分比均明显高于CS组样本,少于NS组样本。6、在骨折术后7天的骨痂内,NS组SSC和BCSP的数目均显著高于另外两组,CS+sgp130Fc组BCSP的数量显著高于CS组,SSC的数量较CS组呈增多趋势,但未达到统计学差异。三组在骨折后3天骨痂内BCSP的增殖活动上未见明显差异,但在SSC的增殖活动方面,CS+sgp130Fc组虽然弱于NS组,但显著强于CS组。7、CS+sgp130Fc组小鼠骨折术后3天骨痂内SSC中STAT3的表达显著低于CS组,高于NS组。研究结论1、本研究通过构建并比较三种品系小鼠长期吸烟作用下骨折愈合模型,发现129X1/Sv J小鼠骨折愈合情况接近长期吸烟者骨折愈合表型,适合用来构建长期吸烟所致骨折愈合不良小鼠模型。2、借助129X1/Sv J小鼠长期吸烟骨折模型,首次揭示了长期吸烟在骨折愈合早期的抑制作用,报道了该阶段关键的细胞学和分子学改变:长期吸烟能够增强骨折愈合早期局部炎症环境,抑制SSC的增殖活动,导致SSC和BCSP在骨痂内扩增不足,可能是引起软骨形成障碍和最终骨折愈合不良的原因。3、通过体外细胞实验,发现IL-6 Trans信号通路是长期吸烟作用下骨折愈合早期局部环境中调节SSC功能的关键分子通路,该通路受到长期吸烟作用而激活,上调SSC中STAT3的表达水平,抑制SSC的增殖活动。在动物实验中,选择性抑制IL-6 Trans信号通路后,吸烟小鼠骨折愈合早期SSC中STAT3表达降低,增殖活动增强,SSC和BCSP在骨痂内扩增增强,软骨形成部分恢复,骨折愈合的质量明显改善。该部分体内、外实验为解释长期吸烟所致骨折愈合不良提供了可能的分子生物学机制,也为未来的进一步研究和临床干预提供了潜在靶点。