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食源性病毒是由食物引起导致人类发生疾病的病毒,由于牡蛎等贝类产品的滤食性特点,对病毒有极强的富集作用。然而食源性病毒检测目前多采用临床腹泻阳性样本和灭活病毒疫苗,存在缺乏统一标准样品的缺陷,这给病毒的检测和定量带来很多问题。本文基于装甲RNA技术,利用Qbeta噬菌体分别研制诺如病毒和甲肝病毒核酸检测用阳性标准样品,对于提高检测的可信性与准确性,保障我国食品安全,促进我国水产品国际贸易、规避国际贸易壁垒均有重要现实意义。1通过人工合成的方式分别制备包含Qbeta噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点、GⅡ型诺如病毒和甲肝病毒检测靶标cDNA序列及辅助多克隆位点的QINVGⅡ和QGBHAV片段。然后通过重组酶分别将QINVGⅡ和QGBHAV片段同源克隆到pET-28a(+)载体中,经过酶切和测序鉴定,成功构建重组质粒 pET-QINVGⅡ 和 pET-QGBHAV。2利用大肠杆菌原核表达系统,分别将重组质粒pET-QINVGⅡ和pET-QGBHAV转入大肠杆菌BL21中,确定最佳表达为IPTG终浓度为0.8mM,37℃诱导12h。经SDS-PAGE电泳验证在14.4kDa左右有目的条带;经透射电镜观察病毒样颗粒直径为27nm,与预期结果一致。证实衣壳蛋白表达成功并能组装成噬菌体病毒样颗粒。3通过超声破碎细菌,经DNase Ⅰ和Rnase A消化后利用CsCl密度梯度离心和纯化。制备的两种假病毒粒子无重组质粒残留,可以用于荧光定量检测。4利用荧光定量PCR技术成功证实两种病毒样颗粒中包装的核酸分别是诺如病毒RNA和甲肝病毒RNA。将病毒RNA梯度稀释后,经RT-qPCR验证线性关系良好,方法检出限为10拷贝/反应,有很好的重复性,可以用于病毒检测用标准样品。定值结果显示制备的含GⅡ型诺如病毒的病毒样颗粒含量为2×109拷贝/μL,瓶间变异系数为3.48%;含甲肝病毒的病毒样颗粒含量为3×109拷贝/μL,瓶间变异系数为4.26%。5将制备好的两种病毒样颗粒分别稀释至2×107拷贝/μL和106拷贝/μL,放置于不同条件下进行稳定性实验。研究结果表明:非冻干状态的样本在37℃能保存半个月,室温可稳定保存25天,2-8℃可稳定放置5个月,-20℃稳定放置至少5个月;冻干状态的样本在37C和25℃下不稳定,在4℃和-20℃能稳定放置5个月。本研究得到了分别含有GⅡ型诺如病毒和甲肝病毒检测核酸序列的两种病毒样颗粒标准样品,可以作为目前临床腹泻阳性样本和灭活病毒疫苗制备的质控品的替代品,适用于疾控、质检、出入境、科研等多个领域中的病毒核酸检测。