研究背景：随着时代的进步,环境的恶化,疾病谱的发展变化,疾病的诊治在现代医学领域里受到了挑战,而中医药在现代临床治疗中逐渐又焕发出新的魅力和迎来新的机遇。中药或中药制剂现已广泛应用于临床,但中药或中药制剂存在着生物利用度低、有效浓度低、起效缓、半衰期短、穿血脑屏障能力差等缺点,严重阻碍其临床疗效的发挥,亦制约了现代中医药的发展。近年来,纳米载药技术已逐渐应用于中医药领域,如中药纳米化、纳米包合技术、聚合物纳米粒载体技术、脂质体纳米粒、固体分散技术等,但仍处于起步阶段,存在许多亟待解决的问题,如纳米中药的药效不确定性以及可能的毒副作用,纳米中药的有效成分和稳定性难以控制等。诸多中药的有效成分为难溶性物质,口服给药吸收差、生物利用度低,故找出合适的方法来提高中药难溶性有效成分的溶解度,改善其生物利用度,是当前中医药工作者面临的主要挑战之一。将中医药复方的有效成分嫁接到磁性纳米微粒上,使其成为生物利用度高、有控缓性能、靶向性的新的药物剂型的研究尚未报道,本课题将从川芎嗪(复方正天丸君药川芎的主要药物成分)的载药开始研究,逐步寻找中医药复方完美的给药途径。磁性纳米材料与中药单体川芎嗪结合组成复合纳米微球,能很好地改善生物利用度低、起效缓、血药浓度低、半衰期短、穿血脑屏障能力差等缺点；磁性纳米粒子具有超顺磁性、小尺寸效应、表面效应、量子隧道效应、磁响应性、生物相容性和生物降解性、功能基团等特性,由于其独特的优势在生命科学领域显示了良好的应用前景。研究目的：通过对磁性纳米微粒的制备、表征以及对牛血清蛋白吸附性能测定的综合评价来寻找一种相对有很好载药潜质的并具有超顺磁性、靶向性和生物相容性等优异特性的磁性纳米微粒作为中药的载体,以便更好地改善中药或中药制剂的生物利用度低、起效缓、血药浓度低、半衰期短、穿血脑屏障能力差等缺点。为川芎嗪寻找一种新的剂型,为偏头痛治疗寻找新的良方。研究方法：1.磁性纳米粒子铁酸钴镍(Ni0.5Co0.5Fe2O4)的制备、表征及其牛血清蛋白(BSA)吸附性能的测定。1.1采用共沉淀法制备Ni0.5Co0.5Fe2O4(NCFO)纳米粉体,以NiCl2·6H2O(98%), CoC4H6O4·4H2O(99.5%)和Fe(NO3)3·9H2O(98.5%)为前驱物,将前驱物按所需的化学计量比分别溶于去离子水中搅拌,然后再将三者混合,将混匀的混合溶液加热至800C恒温,搅拌2小时(h)后,一边搅拌一边往溶液中加入氨水,直到溶液的酸碱度(pH)值约等于8.5,停止加入氨水,然后再搅拌大约30分钟后,再加入酒精球磨24h,最后放置干燥箱中干燥后得到所需的前驱体粉体。将得到的粉体样品在通氮气(N2)气氛下并不同温度(5500C到10500C)下退火。1.2将制备所得的纳米粉体Ni0.5Co0.5Fe2O4样品采用X射线衍射(XRD,(CuKα：λ=1.54056A)技术来表征,所有样品的XRD的扫描步长为0.02°/2s,衍射角从10°-80°。在30kOe的磁场中,采用振动探针式磁强计VSM(MPMS,美国QUANTUM DESIGN公司)对合成的样品进行了磁性能的测试。用无水乙醇分散磁性纳米粒子Ni0.5Co0.5Fe2O4,然后将其置于铜网上晾干,用透射电子显微镜(TEM,HITACHIH7650日本)观察磁性纳米粒子Ni0.5Co0.5Fe2O4的形态和粒径。1.3磁性纳米粒子Ni0.5ECo0.5Fe2O4对牛血清蛋白的吸附性能的测定。具体方法如下：将牛血清蛋白(BSA,纯度>99%))溶解在去离子水中配制成pH等于7.4、浓度为1.000mg/ml的溶液,将适量的磁性纳米粒子Ni0.5Co0.5Fe2O4溶于配制好的牛血清蛋白溶液中,将此混合溶液在常温下超声搅拌2小时,静止沉淀24小时后,用紫外线分光光度计(UV2401pc)来测定磁性纳米粒子Ni0.5Co0.5Fe2O4对牛血清蛋白的吸附性能。2.磁性纳米粒子镍锰酸镧(La2NiMnO6)的制备、表征及其牛血清蛋白(BSA)的吸附性能的测定。2.1采用化学共沉淀法制备La2NiMnO6纳米粉体。具体实验步骤如下：以硝酸镧(La(NO3)3·5H2O(99.5%)),醋酸镍(Ni(CH3COO)2·4H2O(98%))和醋酸锰(Mn(CH3COO)4·4H2O(99%))为前驱物,将前驱物按所需的化学计量比分别溶于去离子水中搅拌,然后再将三者混合,将混合溶液加热至80℃恒温,搅拌2小时后一边搅拌一边往溶液中加入氨水,直到溶液的pH值约等于8.5为止。搅拌大约30分钟后,再加入酒精球磨24小时,然后放置干燥箱中干燥后得到所需的前驱体粉体。将得到的粉体在氮气(N2)气氛下不同温度(750℃,850℃,950℃,1050℃)下退火。2.2退火获得的磁性纳米粉体La2NiMnO6的表征。退火获得粉体样品的采用X射线衍射(XRD,(CuKα:λ=1.54056A)技术来表征,所有样品的XRD的扫描步长为0.02°/2s,衍射角从10°-80°。在30kOe的磁场中,采用振动探针式磁强计VSM(MPMS,美国QUANTUM DESIGN公司)对获得粉体样品进行了磁性能的测试。用无水乙醇分散磁性纳米粒子La2NiMnO6然后置于铜网上晾干,用透射电子显微镜(TEM, HITACHIH7650日本产)观察磁性纳米粒子La2NiMnO6的形态和粒径。2.3磁性纳米粒子La2NiMnO6对牛血清蛋白的吸附性能的测定。具体实验步骤如下：将牛血清蛋白(BSA,纯度>99%))溶解在去离子水中配制成pH等于7.4、浓度为1.000mg/ml的溶液,将适量的磁性纳米粒子La2NiMnO6溶于已配制好的牛血清蛋白溶液中,将此混合溶液在常温下超声搅拌2小时,静止沉淀24小时后,用紫外线分光光度计(UV2401pc)来测定磁性纳米微粒La2NiMnO6对牛血清蛋白的吸附性能。3.磁性纳米粒子铁酸锌镍(Ni0.5Zn0.5Fe2O4)的制备、表征及其牛血清蛋白(BSA)的吸附性能的测定。3.1采用共沉淀法制备Ni0.5Zn0.5Fe2O4纳米粉体,以醋酸镍(Ni(CH3COO)2·4H2O(98%)),醋酸锌(Zn(CH3COO)2·2H2O(99%)),和硝酸铁(Fe(NO3)3·9H2O(99%))为前驱物,将Ni(CH3COO)2·4H2O(98%)和Zn(CH3COO)2·2H2O(99%)溶于36%的乙酸中组成混合溶液甲,将Fe(NO3)3·9H2O(99%)溶于去离子水组成混合液乙,然后再将甲混合液逐滴加入乙溶液中,边滴边用磁力搅拌,同时加热至80℃后恒温,继续将混合溶液磁力搅拌2小时后,一边搅拌一边往混合溶液中加入氨水,直到溶液的pH值约等于8.5为止。然后静止沉淀、自然冷却后过滤,然后放置干燥箱中干燥24小时,取得干燥混合物再加入酒精球磨后预烧,之后再加入酒精球磨后在通氮气(N2)气氛下并不同温度(400℃,500℃,600℃,700℃,800℃)下退火。3.2退火获得的磁性纳米粉体Ni0.5Zn0.5Fe2O4的表征。采用X射线衍射(XRD,(CuKα:λ=1.54056A)技术来表征,所有样品的XRD的扫描步长为0.02°/2s,衍射角从10°-80°。在30kOe的磁场中,采用振动探针式磁强计VSM(MPMS,美国QUANTUM DESIGN公司)对退火所获得的磁性纳米粉体Ni0.5Zri0.5Fe2O4的样品进行了磁性能的测试。用无水乙醇分散磁性纳米粒子Ni0.5Zn0.5Fe2O4然后将其置于铜网上晾干,用透射电子显微镜(TEM,HITACHIH7650日本)观察磁性纳米粒子Ni0.5Zn0.5Fe2O4的形态和粒径。3.3采用紫外线分光光度计(UV2401pc)来分析磁性纳米粒子Ni0.5Zn0.5Fe2O4对牛血清蛋白的吸附性能,将牛血清蛋白(BSA,纯度>99%))溶解在去离子水中分别配制成pH等于7.0和3.0浓度为1.000mg/ml的牛血清蛋白溶液,将适量的磁性纳米粒子Ni0.5Zn0.5Fe2O4溶于牛血清蛋白溶液中,将此混合物在常温下超声搅拌2小时,静止沉淀24小时后,用紫外线分光光度计(UV2401pc)来测定磁性纳米粒子Ni0.5Zn0.5Fe3O4对牛血清蛋白在不同酸碱度的环境下(pH=7.0,3.0)的吸附性能。然后选择吸附力强的pH环境的磁性纳米粒子Ni0.5Zn0.5Fe2O4样品,在常温下超声搅拌不同的时间(30-120min),来观察搅拌时间对牛血清蛋白的吸附性能的影响。4.吐温-80修饰的荧光标记的磁性纳米粒子与川芎嗪组成的复合纳米微粒的制备、表征及其性能的测定。4.1采用共沉淀法制备荧光粉体LaPO4:Eu,将称量好的Y2O3, La2O3和Eu203溶于l0ml浓硝酸+10m1去离子水混合溶液中,然后加热至80℃C,30分钟后全溶,随后将(NH4)2HPO4直接加入,充分搅拌溶解后,调节PH值为9.5,再继续搅拌2小时。过滤后用去离子水反复冲洗,然后放在干燥箱中烘24小时,研磨,预烧。最后在不同温度下退火。4.2复合纳米微粒的制备。具体实验步骤如下：用2毫升(m1)浓度为25%的牛血清白蛋白加入20mmg四甲基吡嗪(川芎嗪TMP),再加入30mg磁性纳米粒子镍锰酸镧(La2NiMnO6退火温度为850摄氏度的样品)、15mg荧光粉体掺铕磷酸镧(LaPO4:Eu退火温度为800摄氏度的样品)充分搅拌,再将搅拌均匀的混合物加入40m1的吐温80中,在常温下超声乳化20分钟(min),再取100m1吐温80加热到120摄氏度,将加热的吐温80置于加热器上维持恒温,将超声乳化后的混悬液以100滴／分钟的速度滴入振荡的预热的吐温80中,加热振荡维持恒温10min；然后用冰冷却至25℃,用无水乙醚洗涤3次,每次用无水乙醚50m1,然后3000转／分钟(R/min)离心15min,离心后的复合物待自然蒸发干燥后,4℃C下保存备用。4.3将制备好的复合纳米微粒采用XRD(CuKα:A=1.54056A)技术来表征,所有样品的XRD的扫描步长为0.02。／2s,衍射角从10。-80。。在30kOe的磁场中,采用VSM(MPMS,美国QUANTUM DESIGN公司)对合成的复合纳米微球样品进行了磁性能的测试。用无水乙醇分散复合纳米粒子,然后置于铜网上,高倍电子显微镜观察复合纳米粒的形态和粒径。4.4使用荧光光度计测量复合纳米微粒中川芎嗪(TMP)的含量,将复合纳米微粒样品按1:5(mg/ml)加入浓度为5%的稀盐酸溶液中,在超声混匀后8℃下静置24小时,然后2000r/min离心l0min,取上清液,用荧光光度计测量川芎嗪含量。4.5复合磁性纳米微粒中川芎嗪(TMP)体外释放测定；精密称取制备好的复合纳米微粒,加入适量磷酸盐缓冲溶液(含0.2%叠氮钠作为抑菌剂,0.1%Tween-80作为润湿剂)为释放介质,置于恒温水浴摇床中,在100r/min振荡速度、37℃条件下进行复合纳米微粒中川芎嗪的体外释放速度测定。分别在设定时间(0.5h、1h、2h、5h、10h、15h、20h、25h、30h、35h、40h)取出,于15000r/min离心15min,吸出上清液后,加入等量新鲜的释放介质。采用荧光光度计测量川芎嗪的含量。计算川芎嗪在磷酸盐缓冲溶液(pH7.4,37℃)中的累积释药百分率,以累积释药百分率对时间作图。4.6复合磁性纳米微粒的细胞毒性测定,采用MTT法检测复合磁性纳米微粒对HepG2人肝癌细胞株增殖活力影响。4.7数据分析：实验结果计量资料用均数±标准差(x±s)表示,细胞毒性实验中,实验组与对照组比较采用单因素方差分析,用统计软件SPSS13.0进行分析,以P<0.05定为差异有统计学意义；累积释药百分率散点图采用曲线拟合法拟合。结果：1.通过化学共沉淀法成功制备磁性纳米粒子Ni0.5Co0.5Fe2O4(NCFO)。X射线衍射(XRD)分析显示各个不同退火的磁性纳米微粒NCFO样品全都为典型的单相立方尖晶石结构,随着退火温度从550上升到950℃C,磁化强度(Ms)从35.95增加到67.19emu/g。当退火温度进一步升高至1050℃时,Ms有所减小。NCFO纳米粒子的饱和磁化强度和晶粒尺寸最初均随退火温度的上升而增加,后又随着退火温度的上升而有所减小。用透射电子显微镜(TEM, HITACHIH7650)来测定磁性纳米粒子NCFO的粒径,所测得的平均粒径约为50nm。磁性纳米粒子NCFO展现出了对牛血清蛋白有良好的吸附性能,当退火温度处于750℃其粒径33.3nm的磁性纳米微粒NCFO样品显示最强的吸附力为71(mg/g)左右。2.磁性纳米粒子La2NiMnO6(LNMO)采用化学共沉淀法成功制备。LNMO的晶粒尺寸极大地受到退火温度的影响。随着退火温度从750℃升高到1050℃,它的平均晶粒尺寸从33.9nm增加到了39.6nm,另一方面,矫顽力随着退火温度的升高先增加,950℃退火,平均晶粒尺寸为37.9nm样品的矫顽力达到最大42.30e,然后随着退火温度的继续升高,矫顽力随之减少。该LNMO纳米微粒表现出了对牛血清白蛋白良好的吸附性能,磁性纳米粒子LNMO在850℃温度下退火样品的BSA吸附能力最强,大约为219.6mg/g。在此情况下,吸附后BSA溶液的体积增加了约3m1。3.采用化学共沉淀法成功制备了磁性纳米粒子Ni0.5Zn0.5Fe2O4(NZFO),通过XRD技术来表征,NZFO粉末形成单一的立方尖晶石结构,并且没有其它杂相的产生。退火温度对磁性纳米粉体Ni0.5Zn0.5Fe2O4晶粒尺寸与磁性能都有一定的影响。随着退火温度的增加,饱和磁化强度增强。在牛血清蛋白溶液的pH=7.0的环境下,退火温度为600℃时的磁性纳米粒子Ni0.5Zn0.5Fe2O4样品对牛血清蛋白的吸附性能为最强,其吸附值约为38.35mg/g。4.经过吐温-80修饰、掺铕磷酸镧(LaP04:Eu)荧光粉体标记的复合磁性纳米微粒(川芎嗪单体、牛血清白蛋白、La(Ni0.5Mn0.5)O3(LNMO-850)、LaPO4:Eu-800、吐温80共同组成的复合物)采用高温使蛋白质固化的原理成功制备。经高倍电子显微镜观察复合纳米微球的粒径约为0.5um,并且测得其有较高的载药量和包封率。通过对复合磁性纳米微粒的体外释放的测定发现,川芎嗪经吐温80修饰和磁性纳米粒子包封后呈现出明显的缓释性能。数据通过曲线拟合,拟合度为0.56476,结果显示复合磁性纳米微粒的半衰期约为25小时。采用MTT法检测复合磁性纳米微粒对HepG2人肝癌细胞株增殖活力的影响,经统计分析,纳米药物组与对照组对HepG2人肝癌细胞株增殖活力比较差异无统计学意义(F=3.153P=0.150),结果显示,在一定浓度范围内复合磁性纳米微粒是安全的。结论：通过对铁酸钴镍(Ni0.5Co0.5Fe2O4)、镍锰酸镧(La2NiMnO6)、铁酸锌镍(Ni0.5Zn0.5Fe2O4)等三种磁性纳米粒子的制备、表征及其牛血清蛋白吸附性能的测定的综合评价后,选择了在氮气气氛中退火温度为850℃的镍锰酸镧作为制备复合纳米微粒的备选磁性纳米粒子样品。经吐温80修饰、掺铕磷酸镧(LaPO4:Eu)荧光粉体标记的复合磁性纳米微粒(川芎嗪单体、牛血清白蛋白、La2NiMnO6(LNMO-850)、LaP04:Eu-800、吐温80共同组成的复合物)采用高温固化的原理成功制备。实验结果表明川芎嗪在复合磁性纳米微粒中有较高的载药量,且经吐温80修饰、磁性纳米粒子包封后呈现出明显的缓释性能。采用MTT法检测复合磁性纳米微粒对HepG2人肝癌细胞株增殖活力的影响,结果显示在适当的浓度范围复合磁性纳米微粒是安全的。本研究利用磁性纳米粒子为载体成功载药中药单体川芎嗪,为川芎嗪提供了一种新的剂型,为中药复方载药打下了坚实的基础,为偏头痛的治疗带来了新的曙光。