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烟曲霉是环境中一种可大量播散孢子的曲霉属真菌,可引起免疫力缺陷人群多种肺部感染。临床中治疗烟曲霉感染主要是唑类药物,其作用机制是通过抑制羊毛甾醇14-α-脱甲基酶活性导致麦角甾醇合成受阻,并使有毒的中间产物甾醇积累,最终导致菌体死亡。但通过药物靶基因突变、药物靶基因高表达或药物外排泵外排可导致烟曲霉对唑类药物耐受水平提高。因而寻找抗烟曲霉新的药物靶点便成了亟待解决的关键问题。本实验室将烟曲霉丝切蛋白Cofilin作为值得关注的治疗烟曲霉感染的潜在药物靶点。Cofilin是真核生物中存在的肌动蛋白结合蛋白,生物学功能涉及肌动蛋白骨架动态平衡调节、线粒体正常功能维持、基因表达调控等。通过前期研究本实验室发现烟曲霉Cofilin与人源Cofilin亲缘关系较远,烟曲霉cofilin表达量对自身致病力具有重要影响。此外,烟曲霉cofilin表达水平升高可导致自身几丁质合成酶编码基因（chsA–chsG）表达水平升高,这一现象可能提高了烟曲霉抗逆性和致病力。本实验室这些前期结果部分地揭示了烟曲霉Cofilin的生物学功能,但一方面烟曲霉Cofilin的生物学功能仍待进一步挖掘,另一方面烟曲霉Cofilin行使其生物学功能的分子机制仍不清楚。为此,本研究主要目的是:1、通过对烟曲霉Cofilin带电荷氨基酸位点功能的研究进一步阐述烟曲霉Cofilin生物学功能;2、通过对烟曲霉中cofilin高表达引起几丁质合成酶编码基因表达水平升高机制的研究,初步探讨烟曲霉行使生物学功能的分子机制。本研究通过丙氨酸扫描方法,将烟曲霉Cofilin中部分带电荷氨基酸突变为丙氨酸,共获得9株Cofilin带电荷氨基酸位点突变株D11A-E12A、D19A-R21A、K26A、K36A、K41A-K42A、E48A、D54A、E56A和R59A-R61A（其中D19A-R21A、K36A、E48A和D54A为本实验室前期构建）。在37℃下生长实验显示D11A-E12A、K26A、K41A-K42A、E56A和R59A-R61A相比野生株（wild-type strain,WT）生长缓慢。此外,K26A和K41A-K42A相比WT对48℃耐受水平显著性下降,但E56A和R59A-R61A在此温度下耐受水平上升。通过免疫荧光实验显示K26A、K41A-K42A、D54A和R59A-R61A的菌丝中肌动蛋白骨架形态异常,提示这些菌株中携带的Cofilin带电荷氨基酸位点突变可能影响Cofilin对肌动蛋白骨架的调节作用。以上结果提示烟曲霉Cofilin带电荷氨基酸在烟曲霉生长、温度适应性、调节肌动蛋白骨架动态平衡中的重要作用。随后,本研究发现Cofilin带电荷氨基酸位点突变株D19A-R21A、E48A和K36A中线粒体功能受到影响,这些菌株中活性氧簇水平相比WT显著性提高,并伴随线粒体膜电位下降、细胞色素c由线粒体释放至细胞质、Metacaspases编码基因表达上调和DNA片段化等经典凋亡过程。并且D19A-R21A和K36A中脂肪酸β氧化过程被激活,因而导致细胞内ATP水平和乙酰辅酶A含量明显上升。乙酰辅酶A升高可能通过影响麦角甾醇合成通路提高了cyp51A和cyp51B的表达水平,而ATP含量升高为药物外排泵提供了更多能量。以上两种情况共同导致了D19A-R21A和K36A对唑类药物耐受水平升高。此外,通过烟曲霉感染大蜡螟实验显示D19A-R21A和K36A的致病力与WT相比显著性上升。紧接着,本研究发现D19A-R21A和K36A对过氧化氢和甲萘醌的耐受水平相比WT明显升高。抑制烟曲霉过氧化氢酶,可基本消除这两株突变菌对过氧化氢耐受水平升高的现象,但对烟曲霉超氧化物歧化酶的抑制却无此效果。通过基因表达结果进一步显示烟曲霉过氧化氢酶编码基因catA和cat1在D19A-R21A和K36A中表达比WT中对应基因表达水平提高,但烟曲霉超氧化物歧化酶编码基因sod1和sod2在D19A-R21A和K36A中表达下降。此外,本研究发现D19A-R21A和K36A中与抗氧化能力相关的转录调控因子编码基因skn7和yap1相比WT中对应基因表达升高。以上结果表明Cofilin中带电荷氨基酸可通过调节线粒体功能影响烟曲霉对唑类药物敏感性、凋亡过程、致病力和抗氧化能力。此外,本研究对实验室前期发现的烟曲霉cofilin高表达引起自身几丁质合成酶编码基因（chsA–chsG）表达水平升高现象的分子机制进行初步探究。通过敲除WT和Cofilin OE（由WT构建的cofilin高表达的烟曲霉突变株）中甘油渗透压通路相关信号蛋白SakA编码基因,Cofilin OEΔsakA中除了chsA和chsE表达水平仍高于WTΔsakA中对应基因外,chsB、chsC、chsD、chsF、chsG表达水平同WTsakAΔ相比下降。当敲除WT和Cofilin OE中烟曲霉Ca2+–钙调蛋白信号通路相关转录调控因子ZipD编码基因后,Cofilin OEΔzipD中只有chsD、chsE、chsF表达水平仍高于WTΔzipD中对应基因,但chsB和chsC表达水平与WTΔzipD相比下降,chsA和chsG在Cofilin OEΔzipD和WTΔzipD中表达水平接近。随后通过基因表达结果进一步显示,zipD表达水平在Cofilin OE中比WT低,但Ca2+–钙调蛋白信号通路中另一重要转录调控因子CrzA编码基因和细胞壁信号通路相关的转录调控因子RlmA的编码基因表达水平在WT和Cofilin OE中差异不显著。以上结果显示Cofilin OE中甘油渗透压信号通路和Ca2+–钙调蛋白信号通路均受到影响,这两个通路共同参与到cofilin高表达影响几丁质合成酶编码基因表达水平升高的过程中。同时,烟曲霉中细胞壁信号通路可能未受到cofilin高表达的影响。综上研究结果,一方面烟曲霉Cofilin中带电荷氨基酸具有重要生物学功能。部分带电荷氨基酸位点突变可直接影响烟曲霉生长、对温度敏感性和肌动蛋白骨架形态。特别是有些带电荷氨基酸位点与线粒体功能具有重要联系,可通过调节线粒体功能影响烟曲霉的麦角甾醇代谢、对唑类药物敏感性、抗氧化能力和致病力。此外,烟曲霉中Cofilin带电荷氨基酸位点突变可激活由线粒体介导的凋亡通路,揭示烟曲霉中Cofilin与凋亡过程存在联系。另一方面,本研究初步揭示了烟曲霉cofilin高表达导致自身几丁质合成酶编码基因表达水平升高是涉及甘油渗透压信号通路中信号蛋白SakA和Ca2+–钙调蛋白信号通路中转录调控因子ZipD的复杂过程。本研究的完成有利于进一步揭示烟曲霉Cofilin生物学功能及其行使这些功能背后的分子机制,为该蛋白作为治疗烟曲霉感染的潜在药物靶点提供理论基础,对临床中科学防治烟曲霉感染、提高患者治愈率和减轻社会财政负担具有重要意义。