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目的:树突状细胞(Dendritic cell, DC)是目前所发现的功能最强、也是唯一能激活初始型T细胞的专职抗原提呈细胞,具有强大的激活T细胞和B细胞的能力,控制着体内免疫反应过程,在免疫应答中处于中心地位。研究表明,肿瘤患者之所以缺乏有力的抗肿瘤免疫应答,原因之一是其体内DC功能缺陷,无法有效提呈肿瘤抗原、激活T细胞识别和杀伤肿瘤细胞。因此,通过体外扩增DC并增强其抗原提呈功能,建立以DC疫苗为基础的主动特异性免疫治疗,已成为肿瘤免疫治疗的研究热点。本实验研究脐血来源DC的培养方法,观察子宫内膜癌冻融抗原致敏DC疫苗体外诱导生成的CTL对子宫内膜癌细胞的特异性杀伤效应,探讨DC疫苗应用于子宫内膜癌免疫治疗的可行性。方法:取对数生长期的子宫内膜癌Ishikawa细胞经反复冻融制备成冻融抗原。体外采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从正常脐血分离出单核细胞,在重组人粒-单核细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、白细胞介素4(rhIL-4)和肿瘤坏死因子α(rhTNF-α)作用下诱导分化为DC。DC经冻融抗原致敏后形成DC疫苗,用以激活T淋巴细胞及诱导生成抗原特异性CTL。利用倒置显微镜观察DC的生长情况及形态变化,扫描电镜观测成熟DC的表面形态。采用流式细胞仪对DC经抗原致敏前后的细胞表型进行测定。经混合淋巴细胞反应(MLR)比较抗原致敏DC、未致敏DC及冻融抗原体外刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。MTT法检测抗原致敏DC诱导生成的特异性CTL对子宫内膜癌Ishikawa细胞的杀伤作用,并以卵巢癌SK-OV-3细胞和肝癌SMMC-7721细胞作对照;同时设立未致敏DC组、冻融抗原组及单纯淋巴细胞组。ELISA法检测致敏DC组、未致敏DC组、冻融抗原组和单纯淋巴细胞组四组培养上清中IL-12和IFN-γ的含量。结果:1 8例脐血标本均诱导生成具有典型特征的DC,细胞体积较大,表面粗糙,扫描电镜下可见细胞表面大量指状突起,细胞表型CD1a、CD83、CD80、CD86及人类白细胞抗原-DR分子(HLA-DR)的表达分别为(45.31±7.42)%、(50.82±8.31)%、(63.04±7.90)%、(67.10±7.95)%及(73.45±8.95)%,能够刺激同种异体T淋巴细胞增殖,刺激指数(SI)为2.45±0.31。2经抗原致敏DC各细胞表型的表达分别为CD1a (53.54±6.82)%、CD83(61.50±8.98)%、CD80(82.51±7.16)%、CD86(82.41±6.90)%及HLA-DR(86.76±6.66)%,均明显高于未致敏DC相应表型的表达,P<0.05(Table1);其刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力(SI=4.49±0.50)也明显高于未致敏DC组(SI=2.45±0.31)和冻融抗原组(SI=1.07±0.12),P<0.05(Table2)。3致敏DC诱导生成的CTL,在10:1,50:1,100:1的效靶比下对子宫内膜癌Ishikawa细胞的杀伤率分别为(39.23±5.11)%、(67.82±7.64)%、(84.34±9.21)%,相应的效靶比下其对SK-OV-3细胞和SMMC-7721细胞的杀伤率分别为(15.14±3.05)%、(25.48±5.59)%、(32.30±5.30)%和(14.15±2.91)%、(21.87±5.30)%、(28.42±4.59)%。CTL对子宫内膜癌Ishikawa细胞有明显的细胞毒作用,明显强于对卵巢癌SK-OV-3细胞和肝癌SMMC-7721细胞的杀伤作用,P<0.05(Table3),并且随着效靶比的增加其杀伤能力逐渐增强,其中以100:1效靶比时的杀伤效能最好(Fig7)。在10:1、50:1、100:1效靶比下,未致敏DC组对Ishikawa细胞的杀伤率分别为(12.55±2.12)%、(24.95±4.13)%、(31.25±5.46)%,相应的效靶比下冻融抗原组和单纯淋巴细胞组对Ishikawa细胞的杀伤率分别为(10.39±1.17)%、(15.79±3.64)%、(22.18±5.18)%和(6.96±1.30)%、(9.40±1.59)%、(10.22±2.51)%。在同一效靶比下致敏DC组的杀伤率均明显高于未致敏DC组、冻融抗原组及单纯淋巴细胞组,P<0.05(Table4、Fig8)。4致敏DC与淋巴细胞共培养产生的IL-12和IFN-γ(228.54±33.39 pg/ml和40.89±4.56 pg/ml)均明显高于未致敏DC组(129.85±21.83 pg/ml和25.54±4.50 pg/ml)、冻融抗原组(21.15±5.14 pg/ml和15.45±4.25 pg/ml)及单纯淋巴细胞组(6.54±2.48 pg/ml和8.29±3.13 pg/ml),P<0.05(Table5、Fig9)。结论:1脐血单核细胞在体外经rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-α联合诱导下可分化为具有大量指状突起的DC,该细胞高表达CD1a、CD83、CD80、CD86及HLA-DR,能够刺激同种异体T淋巴细胞增殖。2 DC疫苗可在体外刺激同种异体T淋巴细胞增殖及诱导产生针对子宫内膜癌Ishikawa细胞的特异性杀伤作用,表明DC可有效提呈子宫内膜癌抗原,激发T细胞产生强大的免疫反应,从而发挥高效而特异的抗肿瘤作用。3 DC疫苗在体外诱导杀伤子宫内膜癌细胞及分泌细胞因子方面均明显强于未致敏DC组、冻融抗原组及单纯淋巴细胞组,表明DC疫苗用于免疫治疗的疗效将明显优于单纯的DC、“常规”疫苗及免疫增强剂。4课题研究为DC疫苗主动免疫治疗子宫内膜癌的体内试验提供了理论依据和实践基础,在子宫内膜癌的进一步免疫治疗方面进行了有益的探索,有望为子宫内膜癌的生物治疗开辟新途径。