铜绿假单胞菌鞭毛马达动力学性质及运动机制的研究

来源 :中国科学技术大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:XUE19880204
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运动性与趋化性是细菌生物物理学相关研究中的两个重要问题,其在环境探索、宿主侵染等生物过程中扮演重要角色。作为一种机会致病菌,铜绿假单胞菌可利用其单根极性鞭毛及Ⅳ型菌毛实现游动、集群运动和蹭行运动。前期对铜绿假单胞菌相关感染的研究证实,烧伤创面脓毒症、获得性肺炎等疾病的高致死率与鞭毛驱动的运动密切相关,因此深入理解铜绿假单胞菌的运动行为对进一步厘清其致病机理具有重要意义。本文以铜绿假单胞菌为研究对象,围绕其鞭毛马达动力学性质及游动机制两大主题展开系统研究:前者侧重鞭毛马达这一大分子机器的胞内运作机制,后者关注游动过程中胞外鞭毛丝的动态行为。细菌运动并非随机过程,其受控于胞内复杂的趋化信号转导网络。在对铜绿假单胞菌运动行为拥有较全面了解后,我们借助计算机模拟技术确定了其在单细胞层面实现高效趋化的运动学因素,并在实验上观察到其鞭毛马达与趋化网络间的紧密联系。对于铜绿假单胞菌鞭毛马达而言,长期以来缺乏对其开展单细胞层面研究的有力手段。我们向鞭毛蛋白FliC中引入半胱氨酸突变点并利用生物素-链霉亲和素系统发展了一种鲁棒的鞭毛丝残端微珠标记技术,通过观察微珠旋转便可得知马达的实时输出特性。借助此法我们对鞭毛马达中两套定子组分的动力学性质进行研究,进而发现二者在作用效果上存在明显差异:MotAB定子负责提供更高的合力矩,MotCD定子确保速度输出的稳定性。通过改变外部环境,我们发现野生型菌株可以动态调整马达上定子组成,这大大增强了其环境探索能力。此外鞭毛马达长时间输出信号采集与非线性滤波数据处理手段的联合使用,使得精确测算马达上定子数目及单定子速度贡献成为可能。铜绿假单胞菌利用跨膜质子电化学势为鞭毛马达旋转提供动力,驱动半刚性螺旋状鞭毛丝旋转进而使细胞发生移动。为更全面的刻画单细胞运动行为,我们利用游离巯基与马来酰亚胺间的偶联作用对活体细胞鞭毛丝进行荧光标记从而观察其动态行为,并提出涵盖“拉动态-缠绕态-推动态”的游动模式。通过观察界面附近细菌运动行为,我们确定了铜绿假单胞菌在推动态和拉动态下的鞭毛丝手性和构象不变性,并在其它周身鞭毛菌株中观察到类似的无鞭毛构象转换的细菌倒退行为,这大大加深了我们对于鞭毛丝重排机制的理解。在系统实验方法研究铜绿假单胞菌鞭毛马达内部动力学性质和外部运动机制的基础上,我们使用基于粗粒化信号通路的趋化模拟方法对单细胞趋化行为进行计算机模拟。模拟结果表明两种定子组分的协同组装以及包含缠绕态的新型运动机制是铜绿假单胞菌实现高效趋化的两个关键因素,由此运动行为与趋化表型间的紧密联系得到了较为坚实的数据支撑。随后我们借助染色体荧光蛋白融合技术发现鞭毛马达与趋化受体团簇在空间定位上具有高度一致性,并确定了影响后者分布的三个因素:极端定位基因flhF,鞭毛马达相关蛋白,胞体曲率。通过构建鞭毛马达组装核心基因(fliG,fliF)敲除株,我们在细菌系统内发现了马达完整度依赖的趋化受体团簇组装机制。从微米级个体游动行为到纳米级大分子机器动力学性质再到胞内分子调控机制,研究尺度由大及小。研究维度延拓的同时加深了我们对铜绿假单胞菌运动学行为的理解,也为将来开展相关研究提供了完善的实验技术手段。本文研究成果为进一步理解铜绿假单胞菌相关宿主-病原体作用机制及其背后包含的生物被膜定植与扩展等实际生理问题做了单细胞运动学层面的理论储备,对研究其它微生物的运动行为亦具有借鉴意义。
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