沙冬青低温胁迫全长cDNA文库构建及AmDHN和AmRD22基因的克隆

来源 :内蒙古农业大学 | 被引量 : 10次 | 上传用户:yufengdong
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沙冬青是我国西北荒漠区唯一的常绿阔叶灌木,具有很强的抗寒和抗旱等抗逆特性。为了发掘其抗寒基因并探讨其抗寒性分子机理,本论文以蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)为材料,用SMART技术构建了其在低温胁迫下的全长cDNA文库,对文库中的部分克隆进行了5’端测序和序列分析,并在此基础上克隆了两个抗逆相关基因的cDNA。主要研究结果如下:1.所构建的原始文库滴度为9.44×106pfu/mL,重组率为98.3%;扩增文库滴度为1.98×1010pfu/mL;插入片段长度在0.52.5Kb,多数接近或超过1kb。这些结果表明文库的质量较高。2.利用PCR方法从文库中挑选出3000个阳性克隆,将其中480个克隆进行5’端测序,得到438条有效EST序列,经拼接获得46个Contig和302个Singlet,合计348个Unigene。3.将Unigene进行blastx比对,有215条可被已知或推测功能的同源基因所注释,其中包括冷诱导蛋白、脱水素、类甜蛋白、防御素、金属硫蛋白、蛋白酶抑制剂、ABA诱导蛋白和转录因子等逆境应答相关蛋白的编码基因。功能未知的新基因有133个。4.以文库中获得的脱水素基因(AmDHN)全长cDNA序列为基础,用PCR方法扩增到其完整编码框cDNA片段,并将其构建到植物表达载体p3301上,然后用农杆菌介导法转化野生型拟南芥,目前已获得T2代转基因植株。5.以本实验室在前期研究中获得的AmRD22基因部分序列为基础,通过RACE技术获得该基因的全长cDNA序列(由1196bp组成),然后用PCR方法从文库中扩增到其完整编码框cDNA片段(由1083bp组成),并构建了其植物表达载体p3301-35S-AmRD22。本论文所构建的cDNA文库和获得的Unigene序列为今后开展表达谱分析、筛选和鉴定蒙古沙冬青抗寒基因提供了平台,对AmDHN和AmRD22基因所做的工作为进一步分析其功能奠定了基础。
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