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目的研究EPCs (endothelial progenitor cells)在缺血缺氧状态下的自噬变化,探讨自噬在细胞存活和增殖中的作用。方法用密度梯度离心法从人脐带血中分离单形核细胞,用VEGFR-2、CD34、CD133抗体标记后通过流式细胞仪(flow cytometry, FCM)分选VEGFR-2+CD34+和VEGFR-2+CD133+细胞,进一步通过免疫细胞化学染色观察VEGFR-2、CD34、CD133在EPCs上的共表达,将分选出的EPCs在VEGF作用下诱导扩增。建立大鼠心肌梗死模型,选择3个部位即正常心肌、梗死周边及梗死区心肌分别将FG (fibrin glue)承载的EPCs注射入心肌组织中。通过半薄切片观察FG承载的EPCs在心肌组织中的分布,透射电镜观察不同部位移植的EPCs的自噬变化。为了明确自噬对细胞增殖和活性的影响,本研究用3-MA抑制EPCs自噬后,通过流式细胞分析细胞周期,MTT法检测细胞活性的变化；在检测缺氧状态下细胞的自噬变化中,该研究在体外模拟缺氧微环境,将分选后的EPCs分为五组：对照组、缺氧1组、缺氧2组、缺氧3组和3-MA组,缺氧1、2、3组分别缺氧30min、1h、2h,在3-MA组中,先用浓度为5mmol/L的3-MA预处理细胞1h,然后缺氧1h。经缺氧处理后,通过免疫细胞化学染色及RT-PCR检测各组细胞自噬基因Beclin-1的表达变化；结合LC3免疫细胞化学染色和MDC染色检测自噬体及阳性细胞数目变化；用透射电镜观察自噬前体、自噬体和自噬溶酶体的形态特征,通过VLCDS图像分析软件测量各组细胞中自噬相关结构与细胞断面面积,对两者比值进行统计学分析及比较；经溶酶体示踪剂lysoSensorTMND-189标记溶酶体后检测其数目变化。为了明确自噬对缺氧状态下细胞存活的作用,本文采用AO/EB染色及流式细胞分析检测自噬对缺氧状态下细胞凋亡的影响。结果与移植于正常心肌的EPCs相比,移植到心梗周边区心肌中的EPCs数量变化不明显并且细胞内出现少量自噬体,但移植到梗死区的EPCs数量明显减少且细胞中出现大量自噬体,还可观察到位于梗死区的EPCs出现坏死变化。在细胞增殖和活性的检测中,观察到与对照组相比,3-MA阻断自噬后,EPCs的增殖指数下降,细胞活性降低。随着缺氧时间的延长,自噬基因Beclin-1表达增强,含LC3或MDC标记的自噬体及阳性细胞数目增多,自噬体主要分布于核周边的细胞质中。透射电镜下观察到的自噬前体可呈新月形或杯状的双层膜结构,新月形自噬前体较厚而杯状自噬前体较薄,自噬体可表现为双层膜包裹的圆形或椭圆形结构,自噬前体或自噬体包绕细胞质样无形结构或受损的线粒体,自噬溶酶体为包绕单层膜自噬体的单层膜结构；与对照组相比,随着缺氧时间的延长,自噬结构与细胞断面面积之比增大,与缺氧1h组相比,3-MA组细胞自噬结构与细胞断面面积之比明显减小。缺氧状态下,溶酶体数目增多且体积变大,3-MA组细胞中溶酶体数目明显降低。在自噬与凋亡关系研究中,检测到缺氧1h可引起少量细胞发生凋亡,阻断自噬后缺氧引起的细胞凋亡数目显著增加。结论自噬与EPCs的增殖和活性维持有关。缺血缺氧诱导EPCs自噬增强,细胞可通过自噬降低缺氧引发的细胞凋亡。