论文部分内容阅读
随着现代工业的迅速发展，工业性氟病的危害也越来越明显，已成为严重危害暴露人群身心健康的公共卫生问题。长期的氟暴露引起氟在机体内不断蓄积，氟负荷超过机体代偿能力而使骨代谢紊乱，导致以广泛性骨质增生硬化等为主要表现的慢性全身性疾病即氟性骨损伤，但其发病机理尚不十分明确。因此，寻找机体拮抗氟致病因素与机制以彻底根治和控制氟危害，成为科学研究防治氟危害的主导方向。氟致成骨活跃和骨转换异常是氟性骨损伤多种病变的共同特征，其损伤与防御的相关信号转导通路的调控是氟性骨损伤发生发展的关键。Wnt/-catenin信号转导通路是调控成骨细胞分化和骨基质形成的关键途径，该通路的活化有利于成骨细胞的分化，使骨形成增加。Sclerostin(SOST)和Dickkopf1(DKK1)作为Wnt通路的负调控因子，在骨形成过程中起着重要作用。但在高氟负荷下，SOST与DKK1是如何发挥调控作用的，至今尚无报道。本研究试图通过动物体内实验的方法，分析染氟大鼠血清中SOST与DKK1的表达变化及与氟性骨损伤相关蛋白因子的关系，分析不同剂量组、不同时间点SOST/DKK1/Runx2/ALP蛋白浓度与氟性骨损伤发生发展的关系，初步阐明SOST/DKK1在氟性骨损伤中的作用及其机制，为氟性骨损伤的防治提供理论依据。第一部分饮水型SD大鼠氟性骨损伤发生过程中相关指标的剂量反应关系研究目的建立饮水型SD大鼠氟性骨损伤模型，探讨氟性骨损伤的发生及有关指标的剂量反应关系，为研究氟性骨损伤发病机制提供科学准确的模型基础。方法选取SPF级SD大鼠64只，随机分为低剂量组(1.6mg/kg NaF)、中剂量组(16mg/kgNaF)、高剂量组(32mg/kg NaF)和对照组(0mg/kg NaF)；采用饮水加氟的方法建立SD大鼠氟性骨损伤动物模型，染氟剂量采用日测体重然后按体重(mg/kg)给予的方法。模型建立过程中对尿氟、血氟进行动态监测，采用微量氟法测定大鼠尿氟和血氟，采用全自动生化分析仪进行测定血清碱性磷酸酶(ALP)，氟斑牙采用数码相机拍照，根据氟斑牙数码照片并按照氟斑牙观测标准进行诊断及分度。对大鼠右腿股骨及骨周韧带和膝关节囊进行组织形态学病理观察与分析。结果大鼠染氟35d时，高剂量组16只大鼠的下切牙均出现氟斑牙，其中93.6%为Ⅱ度氟斑牙，实验第90d末，高、中剂量组16只SD大鼠的下切牙均出现明显氟斑牙；染氟7d后尿氟便开始升高，其中高、中剂量组尿氟水平分别为(8.48±1.19) mg/L、(6.38±0.53)mg/L与对照组尿氟(1.09±0.35)mg/L相比差异有统计学意义(t=13.58，P<0.05; t=37.1,P<0.05)，染氟35d开始，至90d结束，高剂量组大鼠血氟为(0.251±0.05) mg/L与对照组血氟水平(0.086±0.08) mg/L相比明显升高，差异有统计学意义(t=52.4，P<0.05)，高、中剂量组大鼠血清中ALP表达水平为(216.43±34.43) U/L、(218.02±42.81) U/L、对照组为(160.55±41.33)U/L，差异有统计学意义(F=6.635，P<0.05)。染氟剂量与尿氟水平显著相关(r=0.924，P=0.038)；染氟剂量与血氟水平呈显著相关(r=0.948，P=0.026)；高、中剂量组大鼠氟负荷水平明显高于对照组；氟斑牙发生率与染氟剂量呈正相关(r=0.983，P=0.017)。对照组和低剂量组大鼠骨膜由单层的成骨细胞及血管等组成，薄而光滑，骨皮质未发现增厚；高、中剂量组大鼠骨膜、骨皮质增厚明显，部分位置可见骨祖母细胞数量增多。结论染氟剂量愈高则氟斑牙发生时间愈早，染氟剂量与氟斑牙发生率存在明显的剂量反应关系；16mg/kg和32mg/kg的染氟剂量，14d即可发生Ⅰ度氟斑牙，35d即可发生典型氟斑牙；染氟进行到35和90d时，高、中剂量组大鼠血清中ALP水平较对照组明显升高，大鼠骨转换状态开始加速，成骨功能活跃，骨骼是氟的重要靶器官；经90d染氟，高、中剂量组SD大鼠股骨的皮质及骨膜增厚，部分骨皮质及骨膜内可见骨祖母细胞数量增多，高氟可导致致骨损伤。第二部分氟性骨损伤中SOST/DKK1对Wnt/-catenin信号通路的调控作用目的观察染氟大鼠血清中SOST、DKK1、Runx2表达水平的变化，探讨SOST/DKK1在经典Wnt通路调控Runx2表达中的作用，为氟性骨损伤的防治提供理论依据。方法选取SPF级SD大鼠64只，随机分为低剂量组(1.6mg/kg NaF)、中剂量组(16mg/kgNaF)、高剂量组(32mg/kg NaF)和对照组(0mg/kg NaF)；采用微电极法测定尿氟、血氟；全自动生化分析仪测定血清中碱性磷酸酶(ALP)活力；采用酶联免疫吸附试验(ELISA法)测定血清中SOST和DKK1水平；同时采用ELISA方法检测Runx2；分析血清SOST/DKK1水平与血氟、ALP及Runx2等氟性骨损伤指标的相关性。采用SPSS18.0进行数据统计学处理。结果高剂量组在第35d时，SOST血清浓度为(11.55±1.02)μg/L，与对照组(12.91±0.59)μg/L相比，表达开始下降，组间差异有统计学意义(F=4.460, P=0.007)；Runx2血清浓度为(120.42±12.40)μg/L，与对照组(111.21±13.49)μg/L，表达开始升高，差异有统计学意义(q=11.6，P<0.05)；第90d时，高、中剂量组SOST表达水平为(8.86±0.85)μg/L、(9.37±1.31)μg/L，与对照组(12.45±1.33) μg/L相比，表达水平明显下降，组间差异有统计学意义(F=34.318，P=0.000)；Runx2表达(116.76±15.66)μg/L、(104.82±16.19)μg/L，与对照组(89.62±7.15)μg/L相比较，表达显著升高，组间差异有统计学意义(F=15.152，P=0.000)；第90d时，大鼠体内SOST与Runx2表达水平呈明显负相关(r=-0.444, P=0.000)。第35d时，高剂量组大鼠血清中DKK1表达水平为(10.58±1.47)μg/L，与对照组(10.84±1.03)μg/L相比，表达水平有下降趋势但并未出现明显降低，差异尚无统计学意义(F=0.359，P=0.783)；染氟第90d，高剂量组大鼠血清中DKK1表达水平为(7.22±1.76)μg/L，与对照组(10.43±1.04)μg/L比较，DKK1表达明显下降，差异有统计学意义(F=23.047，P=0.000)。染氟后大鼠体内DKK1表达水平与Runx2水平也呈负相关；染氟第35d，大鼠血清中DKK1与Runx2表达水平的相关系数r=－0.018，P=0.887；在染氟第90d，大鼠血清中两种蛋白的表达水平呈现有统计学意义的相关性(r=－0.370，P=0.002)。结论对SD大鼠进行16mg/kg和32mg/kg连续90d的染氟，可导致成骨抑制因子SOST和DKK1表达水平降低，成骨必需的因子Runx2和ALP表达水平升高；氟负荷越高，SOST和DKK1表达水平越低，SOST和DKK1表达水平与染氟剂量存在剂量效应关系；高、中剂量染氟可致氟性骨损伤大鼠体内SOST和DKK1表达水平降低，骨损伤的发生可能与SOST和DKK1表达水平有关；SOST/DKK1的表达降低阻滞Wnt通路作用减弱，进而促进Runx2表达，可以导致氟致骨损伤的发生。