阿司匹林(Aspirin,ASA)又名乙酰水杨酸,其基础作用解热镇痛己应用百年,是医药史上三大经典药物之一,至今仍是世界上应用最广泛的解热、镇痛和抗炎药。据报道,全球每年大约有40000吨阿司匹林药物被用于治疗各种疾病。随着对该药物深入研究,阿司匹林潜在的其它药效如抗癌、延长寿命、抗菌等被研究人员发现。此外,由于阿司匹林的广泛应用,其临床不良反应报道也逐渐增多,如肠道出血、瑞氏综合征、肝肾损伤等。因此,对于阿司匹林药物的具体分子作用机制的研究,不但有利于开发其新的药效功能,还能指导临床用药,避免药物服用过程中的毒副作用。酵母(Saccharomyces cerevisiae)被广泛的应用于遗传和细胞生物学的研究,也是研究药物或化合物作用机制的极好单细胞模型。与高等哺乳动物和其它病原真菌相比,酵母基因易突变、敲除、超表达、标记,能为小分子化合物的分子作用机制提供大量信息。为了深入并系统性的研究阿司匹林药物作用分子机制以及为临床用药提供理论基础依据,本论文利用模式生物酿酒酵母在基因功能及代谢调控中的便利优势对受阿司匹林生长抑制的细胞内靶向基因或信号系统展开研究,本论文的研究内容主要包括以下四个部分:第一部分:基于化学遗传学分析法对酵母全基因组阿司匹林靶向基因或信号系统的筛选为寻找药物阿司匹林可能的分子靶点,利用酵母基因剔除工程突变体库(yeast knockout(YKO)mutants collection),应用基因表达水平细胞药物敏感性分析(fitness-based assays),对包括非必需的4200多个基因的二倍纯合突变体库(homozygous)应用高通量基因芯片技术进行阿司匹林药敏感性筛选,35个基因被初步选定具阿司匹林敏感性,主要包括四类:一为非特异性的药物抗性基因如RPL27A、SSO2、RAD33、ATG39等;二为有关调控饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸合成的基因MGA2、ECI1等;第三类为有关调控几丁质合成和维持细胞壁完整性的基因CDA1、WSC3、SLG1等;第四类为ATP等能量合成及其相关的调控基因COR1、PMA2、ECM31等。对以上筛选到所有药物敏感基因的进行单独药物敏感性的确证。其中第二和第三类基因的干预作用属于阿司匹林化合物药用机理研究完全崭新的发现。MGA2被确定为阿司匹林超敏感基因,推测:阿司匹林干预了细胞的脂肪酸代谢,特别是MGA2介导的非饱和脂肪酸的合成过程可能是阿司匹林在酵母细胞中的靶信号通路。接下来希望应用遗传学、生物化学的技术进一步探究阿司匹林分子机制。第二部分:阿司匹林处理导致细胞内饱和脂肪酸聚积破坏质膜的稳定性在阿司匹林靶向基因筛选中,我们发现MGA2突变表现出对阿司匹林药物的超敏感性。MGA2是调控OLE1基因的重要转录因子,而OLE1基因编码△(9)脂肪酸去饱和酶调节油酸和软脂酸的生成,促进不饱和脂肪酸的生成对于维持细胞膜应力和细胞膜完整性至关重要。基因DCI1与OLE1功能相反,其编码Δ(3,5)-Δ(2,4)-二烯酰-CoA异构酶,负责将不饱和脂肪酸转变为饱和脂肪酸以促进脂肪酸β-氧化,遗传分析缺失DCI1(dci1△)或下调OLE1(mga2△)基因的突变株对阿司匹林分别表现出抗性和敏感表型,过表达DCI1使野生菌对阿司匹林敏感,也能恢复dci1△对阿司匹林敏感性,相反过表达OLE1能削弱DCI1突变诱导的阿司匹林抗性性状。通过GC-MS分析阿司匹林处理下细胞的脂肪酸组成不饱和脂肪酸指数显著下降,在dci1△菌株不饱和脂肪酸指数极显著下降。实时定量PCR分析细胞OLE1、DCI1表达水平分别与阿司匹林处理具有剂量相关性,与脂肪酸组成分析一致,阿司匹林通过促进DCI1、抑制OLE1表达导致细胞内饱和脂肪酸聚积。细胞内脂肪酸成分比例的改变,会影响细胞膜组成、流动性和稳定性。通过细胞膜完整性分析(PI染色检测),我们发现阿司匹林处理细胞膜稳定性下降,质膜破损比例显著增加,这可能是阿司匹林抑制真菌生长的一个主要机制。第三部分:阿司匹林干预酵母细胞壁甘露糖蛋白合成抑制酵母生长虽然第三类关于维持细胞壁完整性的基因CDA1、WSC3等单突变体对阿司匹林没有明显的敏感显性,但通过扫描电镜观察以及细胞疏水性分析,我们进一步确定阿司匹林对细胞壁造成的损伤具有浓度依赖性。通过遗传突变阻断几丁质(chs1△、chs2△或chs3△)或过表达甘露糖蛋白(ALG7、SEC53、DPM1等)合成通路的关键基因开展阿司匹林药物敏感性实验,发现过表达必须基因DPM1能够增强细胞对阿司匹林抗性,RT-PCR和蛋白质印迹(Western Blot)分析表明阿司匹林处理显著下调DPM1表达水平。应用扫描电镜观察证实过表达DPM1能够很大程度上恢复阿司匹林对细胞壁的损伤,进一步研究表明外源增加DPM1p催化底物甘露糖使酵母细胞表现出更强的阿司匹林药物抗性。因而,推测DPM1p可能是阿司匹林的潜在靶蛋白。利用生物信息学方法对药物分子和蛋白分子相互作用展开进一步分子间作用模拟分析,发现了DMP1p蛋白分子上8个潜在的阿司匹林结合位点,为下一步具体靶位点分析奠定基础。此外,在动物细胞实验过程中,发现阿司匹林也能下调HCT116细胞内DPM1基因的表达,暗示阿司匹林的这一作用机制可能具有真核生物的保守性。第四部分:基于色谱分析法对酵母细胞能量代谢产物检测方法的构建以及阿司匹林对细胞能量代谢影响的分析针对基因芯片筛选结果和很多研究报道中,阿司匹林能够引起细胞内能量代谢及其产物如ATP,NAPDH等含量的改变,但其生物学意义并不清晰。测量细胞内能量代谢产物ATP,ADP和AMP的含量,分析生物体内能荷变化动态情况,对于研究细胞代谢和阿司匹林等药物作用机理具有指导意义。为此,我们分别利用高效液相色谱仪和毛细管区带电泳仪,构建了能同时检测ATP、ADP、AMP和cAMP四种能量代谢产物的简单、高效、准确度高的两套检测法。两种方法对于四种核苷酸的检测回收率都达90%以上,适用于动态分析生命过程中酵母体内能量代谢的变化。毛细管区带电泳法相对于液相法因具有更高的灵敏度,及所需样品量少等优点。我们应用毛细管区带电泳法检测阿司匹林对酵母能量代谢影响,发现阿司匹林能够降低酵母细胞内能荷从而抑制酵母的生长。阿司匹林用药广泛、作用机制复杂,本论文通过系统生物学方法利用模型生物酵母,探讨了阿司匹林发挥细胞效应的分子机制,发现阿司匹林干预细胞脂质的代谢,特别是引起非饱和脂肪酸指数下调破坏质膜的稳定性;阻碍酵母细胞壁甘露糖蛋白合成损害细胞壁完整性;明显降低细胞的代谢率造成能荷降低,引起酵母生长抑制现象。为将来深入研究阿司匹林药物作用分子机制以及指导临床用药提供基础数据。