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马钱子是中医临床上的常用药,主要活性成分为马钱子碱和士的宁等生物碱,被广泛应用于治疗风湿性关节炎和神经系统等疾病。但马钱子有较强毒性,导致其临床应用受限,有毒理学研究表明白术可以降低马钱子的毒性,但具体的减毒机制尚未完全清楚。本课题组前期已有研究表明,白术能通过抑制马钱子活性成分的肠吸收降低马钱子毒性,而体外代谢角度白术减马钱子毒性尚未见文献报道,故本文从体外代谢角度出发,研究白术对马钱子在Ⅰ相代谢的酶动力学差异,通过马钱子活性成分的酶代谢表型研究,联合白术对药物代谢酶活性影响研究,探讨白术在代谢方面是否具有降低马钱子毒性的及其机理,此可能为有效评估马钱子的安全等级与对马钱子临床安全用药等都具有重要意义。本文主要工作包括:1.白术对马钱子活性成分的Ⅰ相酶代谢动力学的影响考察;2.马钱子对CYP450酶的相互作用研究;3.白术提取物与白术内酯Ⅱ对CYP450酶的相互作用研究。1.白术对马钱子活性成分的Ⅰ相酶代谢动力学的影响考察本章节采用体外孵育技术,以马钱子碱和士的宁为考察对象,利用底物消除法考察白术与马钱子配伍后马钱子碱和士的宁在大鼠肝微粒体中的酶代谢动力学,通过比较马钱子碱和士的宁的代谢动力学参数得出白术对马钱子Ⅰ相代谢酶的影响情况。结果显示马钱子中马钱子碱和士的宁在肝微粒体中代谢参数Km、Vmax和Clint分别为12.03±2.65和9.27±1.53μg/L,0.15±0.04和0.12±0.02μg/(min·mg protein),0.012 4±0.0007和0.012 8±0.000 3 min/mg;当加入白术与其共同孵育时,随着白术浓度的增加,马钱子碱和士的宁代谢率逐渐减少,分别为马钱子组69.0%±4.4%和70.9%±4.0%、马钱子-白术低浓度组61.6%±2.5%和64.6%±2.4%、马钱子-白术中浓度组57.1%±2.3%和59.9%±1.9%、马钱子-白术高浓度组37.5%±9.1%和42.8%±7.9%,与单独马钱子组比较,马钱子-白术低、中、高浓度组马钱子碱和士的宁代谢率均有显著性差异。由试验结果可知,马钱子碱和士的宁均能显著代谢,代谢率可达30%以上,说明马钱子具有Ⅰ相代谢特征,可以进一步开展关于马钱子的Ⅰ相代谢研究;白术与马钱子配伍后能够降低马钱子活性成分的各项酶动力学参数,表明白术能有效减缓马钱子在肝脏中的清除,推测白术可能与马钱子配伍后相互作用影响马钱子代谢,具体作用机制可能与Ⅰ相代谢酶水平有关。2.马钱子与CYP450酶的相互作用研究本章采用化学抑制剂法对马钱子碱和士的宁的酶代谢途径进行研究,以α-萘黄酮(CYP1A2)、诺卡酮(CYP2C19)、磺胺苯吡唑(CYP2C9)、奎尼丁(CYP2D6)和酮康唑(CYP3A4)作为抑制剂,鉴别参与马钱子碱和士的宁代谢的CYP450酶表型。同时以不同浓度的马钱子提取液与CYP450酶探针药物共孵育,以各酶探针药物的代谢产物生成速率为指标,考察其对各Ⅰ相代谢酶活性的影响情况。结果显示随着各抑制剂浓度的增加,马钱子碱和士的宁的代谢受酮康唑抑制最明显,抑制率大于90%,其次是磺胺苯吡唑,抑制率约为40%,剩余3种抑制剂仅少部分抑制,抑制率约在20%~40%之间,表明马钱子主要经CYP3A4酶代谢,其次部分经CYP2C9酶代谢,而少部分经过CYP1A2、CYP2C19和CYP2D6酶代谢。马钱子提取液对CYP450酶活性影响实验结果显示马钱子对CYP1A2和CYP2D6酶抑制作用较强,其IC50值分别为1.48和0.31 mg/mL,而对其他酶抑制作用较弱,IC50值大于10 mg/mL。上述结果为马钱子经酶代谢途径和影响药物代谢酶活性而产生的可能相互作用提供了依据,对马钱子在临床用药设计等具有重要的理论指导意义,同时可以看出马钱子活性成分主要经CYP3A4酶代谢,但其自身对CYP3A4酶活性并无显著影响,这可推出白术可能CYP3A4酶活性的作用,从而达到降低马钱子活性成分的代谢量。3.白术提取物与白术内酯Ⅱ对CYP450酶的相互作用研究本章首先考察白术提取物对各CYP450酶活性的影响研究,以不同浓度白术与探针药物共孵育,观察白术对各酶的作用情况,紧接着以白术内酯Ⅱ为白术活性成分代表药,进一步研究白术内酯Ⅱ对CYP450酶的相互作用情况。结果表明,白术对CYP3A4酶具有潜在诱导作用,诱导率约为30%,对CYP1A2和CYP2D6具有较强抑制作用,IC50值分别为5.12和4.43 mg/mL,对其他酶抑制作用较弱,IC50值大于100 mg/mL。在白术内酯Ⅱ与CYP450酶相互作用研究中,发现白术内酯Ⅱ主要经CYP3A4酶代谢,部分经CYP1A2和CYP2C19酶代谢,其他酶几乎不参与代谢。白术内酯Ⅱ对CYP450酶的活性研究结果中,发现它对CYP1A2和CYP3A4为非竞争性抑制,Ki值分别为154.51和139.82μM,对CYP2C19、CYP2C9和CYP2D6为竞争性抑制,Ki值分别为200、66.79、138.63μM,综上可以看出,白术内酯Ⅱ不易于与其他药物发生相互作用,且会与马钱子竞争CYP3A4酶代谢。白术提取物与白术内酯Ⅱ对CYP450酶的相互作用研究结果可以证实,白术能够抑制CYP1A2和CYP2D6酶活性,从而减弱马钱子碱和士的宁引起的不期望的药效扩大作用,而白术能部分诱导CYP3A4酶活性,在白术与马钱子代谢竞争过程中,白术与酶结合的能力强于马钱子,从而使CYP3A4酶对白术的代谢增多,相对减少马钱子的代谢,这可能减弱马钱子碱和士的宁因代谢转化成前致癌物质或NO化毒物转化成为致癌物和毒物的几率,此可能是白术降低马钱子毒性的重要机制之一。