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目的:建立超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)在体外诱导儿童外周血单个核细胞(PBMCs)对糖皮质激素产生抵抗的模型。并探讨ERK信号通路在该模型中的作用。
方法：1.密度梯度离心法提取正常儿童外周血单个核细胞(PBMCs),用10 g/ml植物血凝素(PHA)或不同浓度(10，100，500，1000ng/ml)金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)分别刺激培养72h，MTT法检测细胞增殖率，计算刺激指数(SI)。2.(10-9-10-6)mol/L DEX分别加入10 g/mlPHA或10 ng/ml，100 ng/ml，500ng/ml SEB刺激组PBMCs培养72h，通过检测细胞增殖率，判断是否产生激素抵抗。3.将1 mol/LERK抑制剂(U0126)或1 mol/LP38MAPK抑制剂(SB203580)分别加入100ng/ml SEB＋10-6 mol/L DEX组细胞共孵育72h，通过细胞增殖率变化，判断阻滞上述信号途径是否对激素抵抗产生影响。4.间接免疫荧光与激光共聚焦显微镜观察不同组别PBMCs中糖皮质激素受体(GRα)的亚细胞定位，通过计算核浆比，定量反映GRα核转位来说明对激素抵抗的影响及机制。5.Western-blot观察100ng/ml SEB刺激组和10 g/mlPHA刺激组ERK活化时程。
结果：1.MTT结果表明，10-1000ng/ml的浓度范围内SEB与10μg/ml PHA刺激的PBMCs刺激指数(SI)无明显差异。2.10-6 mol/L DEX作用于10 ng/ml，100 ng/ml，500ng/ml SEB刺激组细胞增殖率分别为80.2[％]，86.6[％]，89.7[％]，而作用于PHA组细胞增殖率为1.8[％]，与PHA组相比p<0.01，说明超抗原SEB使细胞对DEX减少增殖的作用出现抵抗，而PHA则无。3.加入1μmol/L ERK抑制剂(U0126)共孵育72h，100ng/ml SEB组细胞对终浓度为10-6 mol/L DEX其增殖率由86.6％降至2.1[％]，而加入1μmol/LP38MAPK抑制剂(SB203580)细胞增殖率为80.1[％]，说明U0126基本消除了超抗原SEB诱导的激素抵抗作用，而SB203580无此效应。4.激光共聚焦显微镜发现,PHA刺激组无DEX作用时GRα主要分布在胞浆(核浆比1.21),加入DEX后趋向分布于胞核(核浆比1.67)。而SEB刺激组DEX作用前后GRα均趋向分布于胞浆(核浆比分别为1.20，1.18)。1 mmol/L的ERK抑制剂U0126预处理细胞2 h，能促进SEB＋DEX组GRα的胞浆向胞核的转运，增加核内分布，核浆比由1.18增至1.56(p<0.01)。而P38MAPK抑制剂SB203580对DEX作用前后GRα的亚细胞分布没有明显影响。5.Western-blot检测发现与PHA相比，SEB可更早更强诱导ERK1/2磷酸化，作用1分钟后即出现p-ERK1/2，且表达持续时间显著长于PHA，在24h仍维持在高水平表达。
结论：超抗原SEB体外可以诱导GRα的核转位障碍，导致糖皮质激素抵抗发生,其发生机制与ERK信号通路活化有关。ERK高水平的持续活化是产生皮质激素抵抗的重要机制，ERK抑制剂可逆转皮质激素抵抗发生。SEB体外刺激后导致的糖皮质激素抵抗可以作为激素抵抗的体外模型。