背景与目的:肿瘤微环境是指肿瘤细胞与宿主组织和细胞之间形成的相生相克的微生态环境。尽管近年有关肿瘤微环境的研究进展迅速,但所得数据受伦理学限止,仍然主要来源于实验动物模型而非人体,因此搭建模拟性高的实验动物模型平台还是肿瘤学研究者十分关注的重要问题。就肿瘤免疫炎性微环境而言,建立人肿瘤动物模型的要求比建立普通动物模型的要求更高,必须能确切地反映出那些被肿瘤细胞重构的肿瘤组织和肿瘤边缘的宿主源性免疫炎性细胞的来龙去脉,最好还要搞清楚这些细胞在肿瘤发生发展中所起的相生相克作用。基于上述原因,本文旨在本课题组早先建立表达红色荧光蛋白(RFP)的人脑胶质瘤干细胞和表达绿色荧光蛋白(GFP)的裸小鼠(RFP+/GFP+双色荧光示踪)模型的基础上,进一步探讨胶质瘤干细胞诱发肿瘤免疫炎性微环境的相关问题,尤其是高压氧如何改变肿瘤微环境的一些情况。材料与方法:接种用的人脑胶质瘤干细胞SU3和转RFP基因的SU3-RFP,表达绿色荧光蛋白的NC和Balbc裸小鼠,接种肿瘤细胞用的套管针和维持SPF级的高压氧治疗系统-HBOT/IVC都是本课题组研制的。接种肿瘤细胞的方法,根据接种部位的不同而有差别,若是脑内原位接种,则借助立体定向仪,经钻颅孔缓慢注射;若是皮下接种,则用套管针将肿瘤组织块或用青霉素皮试注射器将肿瘤细胞混悬液注入前肢腋下或足掌;若是肝脏接种,则须右肋缘切开,将肿瘤细胞通过微量泵缓慢注入肝组织内;若是腹腔接种,用青霉素皮试注射器将肿瘤细胞直接推注入腹腔即可。至于接种肿瘤细胞的量,根据接种部位和实验需要观察的指标而定,若是皮下接种肿瘤组织块,一般用1-3 mm3,细胞混悬液为106-107个细胞/0.5 ml培养液;若是脑和肝内接种,一般用细胞混悬液105个细胞/10-15μl培养液。至于肿瘤免疫炎性微环境观察,都需取移植瘤,必要时还要包括肿瘤边缘组织做冰冻切片和常规石蜡切片后在白光和荧光显微镜下观察表达GFP的细胞分布,通过ipps6.0软件量化分析其表达。若要鉴定在肿瘤及边缘组织显示gfp细胞中的免疫炎性细胞比例,则必须要用免疫组织化学方法检测这些细胞固有的标志蛋白。当然,也可通过组织消化后的混悬液用流式细胞仪进行测定比例,或采用分离收集培养等方法随实验目的不同而加以选择。为了观察高压氧对肿瘤的影响,将皮下接种su3的裸小鼠放置在hbot/ivc装置内进行高压氧治疗,每天一次,每次100分钟,连续21天,而单独化疗药acnu组小鼠给予腹腔注射acnu30mg/kg,每周一次,共3次,实验结束时取出肿瘤组织后进行称重。用微电极测定肿瘤组织内的氧含量。结果与分析:在脑内移植瘤组织中,光镜下可见肿瘤组织出血、坏死和血管增生,肿瘤细胞呈侵袭性生长的恶性表型。在荧光显微镜下,能清楚地可见发红色荧光的肿瘤细胞、发绿色荧光的宿主细胞和rfp/gfp双阳性的黄色细胞,在肿瘤坏死灶中和肿瘤边缘见有大量绿色的炎性细胞浸润。在皮下移植瘤组织中,可见肿瘤微环境相关蛋白和宿主髓源性抑制细胞(myeloid-derivedsuppressorcells,mdsc)的标记物包括hif-1α、tnf-α、ki67、cd68和cd11b的高表达,在移植瘤间质中,也可见有较多的gfp+、cd68+和cd11b+细胞。移植瘤经高压氧治疗后,肿瘤重量减轻,尤其与化疗药acnu合用的肿瘤重量更轻。在腹腔移植瘤组织的病理切片上,荧光显微镜下可见肿瘤结节中包含了rfp+红色细胞、gfp+绿色细胞及rfp+/gfp+的黄色细胞。在将肿瘤结节再培养后,gfp+细胞可恶性转化为高表达cd68的癌细胞。在足掌移植瘤近心端的肿瘤边缘组织,光镜下可见到肿瘤细胞核深染,异形性明显,核分裂常见,细胞排列密集,而在荧光镜下清晰地可见移植瘤组织中存在来源于循环血液的免疫炎性细胞。在肝移植瘤组织中,光镜下可见su3细胞在异位的肝组织内排列密集,核大、深染,并向周围正常肝组织侵袭生长。荧光镜下可见有绿色宿主细胞与红色肿瘤细胞的交织存在,其中包括肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophages,tam)。共聚焦显微镜下可进一步清楚地看到这两类细胞发生融合或吞噬的黄色细胞。经流式细胞仪检测到的红、绿和黄色细胞分别为73.65%、19.56%和6.79%。这些黄色细胞单克隆化后获得具有无限增殖能力的b4、b9和b10细胞,b4细胞可表达rfp/gfp,而b9和b10细胞仅表达gfp。b4细胞还表达cd1a、cd83和cd86等树突状细胞的分子标记蛋白,B9和B10细胞可分别表达CD68、F4/80和FAP-α、α-SMA、S100等巨噬细胞和成纤维细胞的分子标记蛋白,经病理诊断它们均为恶性肿瘤细胞。采用微电极测得移植瘤组织中氧含量,在常态下的头皮下移植瘤中的平均氧含量为(28.93±8.06)mmol/L,脑内移植瘤的平均氧含量为(47.46±15.96)mmol/L。经HBO治疗后,脑内移植瘤在治疗出窗时的平均氧含量增加为(86.61±10.91)mmol/L,与前者相比有显著差异(P<0.01)。HBO治疗后的免疫炎性细胞明显减少。结论:(1)本课题组所建的RFP+/GFP+双色荧光分别示踪人脑胶质瘤干细胞和宿主组织细胞的模型,与传统人脑胶质瘤干细胞移植普通裸小鼠模型相比,其独特的优势除了依赖荧光显微镜就可以区别出肿瘤微环境中哪些是肿瘤细胞,哪些是肿瘤间质细胞外,还能界定出RFP+/GFP+共定位在一个细胞上的黄色细胞,即是肿瘤细胞与宿主细胞发生了融合的细胞;(2)基于肿瘤免疫炎性反应是肿瘤局部的全身性反应,而且参与反应的细胞,主要来自骨髓中的髓源性抑制细胞,因此肿瘤细胞接种部位相对不重要,重要的是如何鉴定和量化这些免疫炎性细胞;(3)RFP+/GFP+的人脑胶质瘤干细胞移植瘤模型,对研究肿瘤微环境而言,可进一步用于肿瘤微环境对肿瘤生长、侵袭、播散和转移等起正面或负面影响、以及肿瘤微环境细胞自身恶性转化及其耐放化疗等多方面的研究;(4)通过本模型证明,HBO治疗可改善肿瘤微环境乏氧而抑制肿瘤免疫炎症反应来提高胶质瘤化疗的敏感性。