背景头癣是头皮及头发的浅部真菌感染,主要通过直接或间接接触患者或患病的动物传染。头癣一度受到控制,但由于近年来人们生活方式的改变,饲养宠物的流行,抗生素的滥用、皮质类固醇激素及免疫抑制剂的使用使得头癣的发病率逐年增加。目前国内外流行病学显示头癣的主要致病菌为犬小孢子菌。头癣好发于学龄前儿童,感染初期为无症状,可通过公用物品如枕头、梳子等传染,因而易出现扩散传播等问题,且预后因头皮化脓感染易形成瘢痕,或因发根毛囊破坏而导致永久性秃发,严重危害患儿的身心健康。目前头癣病因尚不清楚,且无相应的防预措施。因此研究头癣的致病因子,寻找有效的疫苗预防头癣的发生意义重大。大量相关数据显示头癣的发病与犬小孢子菌分泌的蛋白酶有关,包括角蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶、酯酶、神经酰胺酶等,其中角蛋白酶的致病性比较明确。前期课题组根据头癣好发于儿童这一临床现象,设计出以成人头皮组织、儿童头皮组织及儿童光滑皮肤为不同诱导底物,比较犬小孢子菌产生的差异基因,从而寻找头癣的致病因子,其中筛选出基因片段之一为FSH1基因。通过实时定量PCR技术得出 FSH1基因在儿童头皮组织培养基中较光滑皮肤组织培养基中呈高度上调表达,其中上调倍数44.6;且犬小孢子菌头癣株FSH1 mRNA表达水平明显高于体癣株,经儿童头皮或包皮诱导后犬小孢子菌FSH1 mRNA表达水平较诱导前明显升高,再次证实FSH1可能与犬小孢子菌在头癣致病性密切相关。因此为验证FSH1基因是否为犬小孢子菌的致病因子,明确其在头癣发病中的作用,我们进行了本文的研究。目的1.根据犬小孢子菌FSH1基因片段克隆其全长序列;2.构建犬小孢子菌FSH1基因干扰株;3.比较犬小孢子菌在FSH1基因沉默前后表观形态学及感染动物能力的不同进而推断犬小孢子菌FSH1基因的功能,明确其是否为犬小孢子菌所致头癣的毒力因子;4.对犬小孢子菌FSH1蛋白进行亚细胞定位分析。方法1.提取犬小孢子菌总RNA,根据犬小孢子菌筛选出的FSH1基因片段设计引物,采用Race技术扩增FSH1基因全长并对其进行比对分析,根据生物信息学的结果推断其蛋白的功能。2.利用根癌农杆菌介导RNA干扰技术对犬小孢子菌FSH1基因进行敲低,构建犬小孢子菌FSH1干扰重组质粒pCB309-PFUFT-FSH1,并以实时定量PCR检测犬小孢子菌FSH1基因mRNA的表达。3.比较FHS1基因沉默前后菌落生长的速度、菌落的形态、光镜下菌丝孢子的形态以及电镜下超微结构等表型的改变;以及感染豚鼠模型皮肤的临床症状及病理改变、毛发入侵程度等致病力的改变。4.以前期构建的犬小孢子菌FSH1质粒及载体CAMBIA-LRP-EGFP为模板,PCR扩增FSH1基因及EGFP基因;同时利用SnaBI/KpnI对pCAMBIA-LRP-EGFP质粒双酶切获得载体DNA,将扩增的EGFP基因In Fusion克隆至酶切好的载体DNA中获得EGFP表达载体;将扩增的FSH1基因及EGFP基因In Fusion克隆至酶切好的载体DNA中获得融合载体pCAMBIA-FSH1-EGFP。并通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法,将重组质粒转化犬小孢子菌,使融合基因FSH1-EGFP在真菌通用启动子(Ptrpc)和终止子(Ttrpc)调控下在犬小孢子菌中整合型表达,利用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的细胞定位。结果本论文为犬小孢子菌基因功能基因组学的研究技术奠定了基础,主要研究结果如下:1.成功扩增了 FSH1基因的全长cDNA序列,其全长片段为945bp,其开放阅读框长度为831bp,编码276个氨基酸,序列分析表明其5’端非编码区大小为44bp,3’端非编码区大小为70bp。通过BLAST同源性分析,其保守区域蛋白为丝氨酸水解蛋白(FSH1蛋白),属于αβ水解酶亚家族。2.成功构建了犬小孢子菌FSH1基因的沉默载体PCB309-PFUFT,并获得大量的转化子。实时荧光定量RT-PCR检测了犬小孢子菌野生株转化子中FSH1mRNA的表达水平较沉默前下降约70%,标准株中下降约60%。3.成功对犬小孢子菌FSH1基因的功能进行了分析。通过比较犬小孢子菌野生株及其干扰株、标准株及其干扰株的表型改变,得出野生株干扰前后在SDA平板上两者菌落生长速度无明显差异,但色素发生了改变,犬小孢子菌干扰株较野生株色素颜色较淡;在米饭培养基上干扰株菌落较野生株相对较厚,颜色呈白色,而野生株成黄色;在光学显微镜下干扰株的大分生孢子菌分隔明显减少或缺如。在扫描电镜下干扰株大分生孢子表面变得光滑,其表面突起明显减少。在透射电镜下干扰株较野生株变化明显,细胞形态出现不规则,细胞膜明显变薄,细胞器破坏,细胞质溶解出现空泡状。而标准株组标准株及其干扰株在肉眼、镜下均未见明显区别。同时对野生株及其干扰株构建了动物模型比较两者致病力的区别,得出干扰株感染豚鼠肉眼上临床症状较野生株轻,皮疹面积小,病理显示干扰株炎症较野生株轻;PAS染色显示干扰株在感染的豚鼠的毛囊内较野生株聚集菌丝孢子明显减少。4.成功对犬小孢子菌FSH1蛋白进行亚细胞定位分析,与阳性对照相比,共聚焦显微镜显示其蛋白定位犬小孢子菌的细胞质及细胞核中。结论1.犬小孢子菌FSH1基因全长为945 bp,其开放阅读框长度为831 bp,编码276个氨基酸,其假定的保守结构域蛋白为编码丝氨酸水解酶FSH1。2.构建了一种适用于犬小孢子菌基因沉默载体,可用于犬小孢子菌基因功能的研究。3.犬小孢子菌FSH1基因沉默使犬小孢子菌感染豚鼠的致病力降低,推断出FSH1是犬小孢子菌在头癣发病中的致病因子之一。FSH1基因沉默后对犬小孢子菌大分生孢子的分隔明显减少或缺如,推断FSH1与犬小孢子菌的大分生孢子分隔的形成有关。超微结构显示FSH1基因沉默后使犬小孢子菌细胞膜、细胞壁及细胞质也出现了改变,表明FSH1与犬小孢子菌的细胞膜、细胞壁及细胞质的形成有关。4.构建了一种适用于犬小孢子菌表达载体,可用于犬小孢子菌基因的表达调控、蛋白定位转运等功能的研究。5.犬小孢子菌FSH1蛋白定位于犬小孢子菌的细胞质及细胞核中,这将为今后其具体的致病机制研究及抗真菌药物的开发奠定基础。