缺氧诱导大鼠海绵体平滑肌细胞表型转化及红景天苷干预作用

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背景:阴茎勃起功能障碍是临床上一种常见疾病,一线药5-型磷酸二酯酶抑制剂仍有35%患者治疗无效。海绵体平滑肌细胞是调节阴茎勃起及维持勃起的重要功能单位。各种诱发因素如糖尿病、高血压、高血脂、前列腺癌根治术和心血管系统疾病等导致阴茎海绵体缺氧和平滑肌细胞减少等是ED并发症主要的病理生理学共性。近年来大量研究发现平滑肌与多组织器官纤维化密切相关,在缺氧等多种因素刺激下,通过发生表型转化参与组织重构。而海绵体平滑肌是否参与阴茎海绵体纤维化尚未报道。红景天苷具有抗缺氧作用,这在国内外均有大量报道。目的:研究体内外缺氧对SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞(CCSMC)表型转化及红景天苷的干预作用。方法:1.体外部分:采用组织贴壁法和酶消化法体外分离培养SD大鼠海绵体平滑肌原代细胞;应用细胞免疫荧光、透射电镜方法鉴定SD大鼠CCSMC;采用缺氧小室建立细胞缺氧模型,并通过光镜、透射电镜检测缺氧前后CCSMC形态及结构变化;采用MTT法和流式细胞技术检测CCSMC缺氧前后细胞活力、周期及凋亡情况;采用免疫组化、Western blotting和定量PCR等技术检测CCSMC缺氧前后缺氧诱导因子(HIF-1α)、细胞表型相关标志物蛋白和基因(a-SMA、 Vimentin、CNN1等)水平及其相关转录因子(Myocd、Elk-1及KLF等)水平;并进一步运用腺病毒技术沉默和过表达CCSMC的HIF-1α基因,验证缺氧介导CCSMC表型转化。2.体内部分:采用切除SD大鼠双侧海绵体神经方法建立大鼠ED缺氧模型,12周后采用多功能生物信息采集器检测ICP;取阴茎组织固定。采用透射电镜、HE染色等方法观察阴茎海绵体结构、形态的改变。采用MASSON染色评估海绵体组织纤维化程度及采用免疫组化、Western Blotting等方法检测阴茎海绵体组织HIF-1α表达水平及平滑肌表型转化相关标志蛋白α-SMA、Vimentin等表达水平。3.红景天苷干预作用观察:1)细胞部分:采用红景天苷低剂量(3ug/mL)与高剂量(30ug/mL)预处理细胞,再进行缺氧48小时。采用光镜、透射电镜观察缺氧前后CCSMC形态及结构;采用MTT法、流式细胞技术检测红景天苷对缺氧CCSMC模型的细胞活性及凋亡情况的影响;采用Western Blotting检测红景天苷对缺氧导致CCSMC表型转化情况的影响,包括缺氧诱导因子HIF-1α表达和胶原(Collagen Ⅲ)合成、细胞表型标志蛋白(a-SMA、Desmin、Vimentin等)表达量的改变。2)动物部分:SD大鼠双侧海绵体切除模型同上,分为假手术组、模型组和红景天苷组。给药组给予红景天苷6mg/kg,灌胃,一天一次,共12周,假手术组和模型组给予等量的水灌胃处理。12周后,ICP检测及海绵体组织缺氧、纤维化及平滑肌细胞表型转化等相关指标检测同上。结果:1原代分离培养的CCSMC呈现梭形,a-SMA、desmin表达具有较高的阳性率,电镜显示细胞内可见大量肌丝;缺氧后出现CCSMC形态肥大,细胞内肌丝减少、粗面内质网增多等变化。CCSMC缺氧后,在HIF-1α表达增高,TGF-β和胶原(collagen)合成增多;平滑肌细胞表型调控转录因子Myocd和Elk-1和KLF-4分别上调和下调;同时,CCSMC收缩型标志蛋白表达水平明显下降,而CCSMC合成型标志蛋白表达水平明显增高。HIF-1α沉默或过表达能分别逆转或促进CCSMC表型转化过程。2.SD大鼠双侧海绵体神经切除后,勃起功能减退;平滑肌细胞出现肥大、肿胀变形,细胞核亦肿大变圆,肌丝减少或消失,细胞器肿胀、空泡化明显等征象。海绵体胶原分泌增多、平滑肌相对含量下降,发生纤维化;海绵体组织发生HIF-1α表达增高,海绵体组织平滑肌细胞α-SMA蛋白表达下降,Vimentin表达增加等变化。3.红景天苷能抑制体外缺氧诱导的CCSMC细胞凋亡,及CCSMC收缩型蛋白的表达下降和合成型蛋白的表达增高等改变;体内检测结果显示红景天苷能有效降低阴茎海绵体组织缺氧诱导因子HIF-1α表达和纤维化程度;此外,红景天苷还能有效升高海绵体平滑肌细胞收缩型标志蛋白的表达和降低合成型标志蛋白表达。结论:1.成功建立了体外分离培养SD大鼠阴茎海绵体平滑肌原代细胞方法;2.成功建立体外CCSMC缺氧模型;3.体外缺氧导致CCSMC表型转化,HIF-1α参与CCSMC表型转化调控;4.成功建立了SD大鼠双侧海绵体神经切除ED缺氧模型;5.SD大鼠双侧海绵体神经切除ED缺氧模型导致阴茎海绵体组织纤维化及平肌细胞表型转化;6.红景天苷对缺氧诱导大鼠海绵体平滑肌细胞表型转化具有抑制作用。
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