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目的:(1)本研究基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)技术,构建白色念珠菌快速检测方法并优化应用,以期为白色念珠菌的快速检测提供技术支持,为白色念珠菌的诊断与防治提供新的可行性方案。(2)实验一,针对白色念珠菌构建了一种实时荧光重组酶聚合酶扩增快速检测方法,并对临床分离株进行了检测,以评测该方法的临床适用性。(3)实验二,为了进一步推广该技术应用于床旁、基层甚至于家庭检测,针对白色念珠菌现场快速检测(Point-of-care testing,POCT)的需求,构建了侧流层析试纸条(Lateral flow strip detection,LFD)结合重组酶聚合酶扩增的快速检测方法(LFD-RPA),实现检测结果的便捷化(easy-to-answer),简化对检测结果的判读。方法:(1)实验一:首先,选取白色念珠菌标准株核酸序列保守区ITS2作为鉴定基因,结合exo+试剂盒指南设计一系列的引物及探针,并通过引物筛选实验,选出最适的引物、探针进行后续实验;其次,取1株白色念珠菌标准株,以铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、光滑念珠菌等5株非白色念珠菌菌株为阴性对照菌,提取DNA为模板,依次采用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)、实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)及实时荧光RPA进行检测,检测结果送测序并在NCBI进行比对,分析三种方法检测白色念珠菌的特异性并统计其检测的总时长;然后,取1株白色念珠菌标准株进行复苏、摇菌并提取基因组,进行PCR获取目的片段,构建质粒标准品,测定浓度并计算出相应的拷贝数/μL,随后进行倍比稀释,取浓度为10~7~10~1拷贝数/μL的7个样品,分别采用上述三种方法进行实验,以光滑念珠菌为阴性对照菌,每个梯度至少设定3次重复,同时分析其检测白色念珠菌的灵敏性;最后,以白色念珠菌标准株为阳性对照,阴性对照菌同前所述,采用试剂盒、加热煮沸、液氮反复冻融分别进行DNA提取,对31份疑似感染白色念珠菌的临床样本和1株棉拭子取材的白色念珠菌感染的临床样本进行实时荧光RPA检测,以PCR检测结果作为参考,并检验DNA粗提取方法是否可行。(2)实验二:首先,同样选取ITS2作为鉴定基因,参照侧流层析试纸条说明与nfo+试剂盒设计指南,对上述针对exo+试剂盒已筛选出的最适引物及探针稍作修改,确定本次实验的引物与探针;其次,取1株白色念珠菌标准株,以5株阴性对照菌(同上述),对实验的反应温度、检测时间进行摸索筛选,确定此次实验的最适反应温度和时间,同时分析检测的特异性并计算检测总时长;然后,采用上述构建成功的7个质粒标准品进行实验,每个梯度至少设置3次重复,统计检出下限,分析其检测白色念珠菌的灵敏性;最后,对白色念珠菌临床样本进行检测,以光滑念珠菌为阴性对照菌,并与PCR、实时荧光RPA检测方法的检测结果进行比对,分析是否一致。结果:(1)3种方法检测中白色念珠菌标准株均出现阳性结果,扩增结果送测序并在NCBI中比对成功,PCR、qPCR、实时荧光RPA检测总时间分别为133、78、35 min;PCR、qPCR、实时荧光RPA的检测下限均为1×10~1拷贝数/μL,阴性对照均未出现阳性结果,在实时荧光定量PCR、RPA检测中,随着质粒标准品的浓度增加,扩增曲线达到阈值线所需要的循环数越少,检测到阳性结果所需的时间越短,实时荧光RPA检测结果显示:质粒标准品的浓度梯度与检测时间之间呈明显负相关(R~2=0.91,P<0.01),此项实验是可重复的;实时荧光RPA对31份疑似感染白色念珠菌临床样本的阳性检出率为32.26%(10/31),略低于PCR的35.48%(11/31),10份经双方均鉴定成功的白色念珠菌临床样本,经实时荧光RPA与PCR检测均出现阳性结果,阴性对照均未出现阳性结果,采用试剂盒、加热煮沸法提取DNA进行RPA,扩增曲线达到阈值所需时间分别为(438±13)、(462±12)s,二者相近(t=1.32,P>0.05),液氮反复冻融法提取DNA进行实时荧光RPA,扩增曲线达到阈值所需时间为(584±15)s,明显多于另外2种方法(t=7.55、6.39,P<0.01),用粗提取方法提取的样品作为检测对象是可行的。(2)在RPA结合侧流层析试纸条的检测中,我们发现除白色念珠菌外其余对照病原菌均未出现检测条带,检测总时长为30min;LFD-RPA检测经摸索筛选出本次实验的最适反应温度为37℃,最适反应时间为10 min;其检测的最低限度为10~1拷贝数/μL,实验结果重复性良好;LFD-RPA对31份疑似感染白色念珠菌临床样本的阳性检出率为41.93%(13/31),对白色念珠菌临床样本的检测结果中PCR与之相比阳性符合率为84.62%(11/13),实时荧光RPA与之相比阳性符合率为76.92%(10/13)。结论:(1)成功地构建并优化实时荧光定量RPA检测白色念珠菌具有检测快速、操作简单、敏感性高、特异性好等优点;反应体系的体积约减少为推荐使用量的1/3,加之结合核酸粗提取方法,仍能稳定、较好地完成检测,使得实验成本大大降低,并且检测比常规PCR、qPCR进一步节省时间,可满足大规模样本高通量快速检测的需求;检测需要具备荧光检测装置,更适用于具备条件的实验室团队及临床检测中心推广应用。(2)在实时荧光定量RPA的基础上,进一步构建优化了LFD-RPA对白色念珠菌检测,可实现完全脱离检测设备,仅需要一台水浴锅甚至体温即可提供反应所需温度;检测结果既特异又敏感,可直接通过裸眼判读,适合未经培训的人员操作,可在即时诊断(Point-of-care testing,POCT)和资源受限的环境中得到推广应用。