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目的：肿瘤的免疫逃逸是肿瘤得以发生、发展的关键因素,其中肿瘤诱导大量的免疫抑制分子构成的信号通路有效的抑制了免疫系统对肿瘤组织的杀伤效应。本研究主要设计并表达小鼠钙网蛋白(Calreticulin,CRT)与可溶性程序性死亡受体1(programmed cell death1)胞外段的融合蛋白 CRT-sPD1,并论证融合蛋白阻断PD1/PDL1信号通路并靶向的将具有促进抗原提呈的CRT携带到肿瘤分子表面诱导特异性抗肿瘤免疫应答,介导免疫系统对肿瘤的杀伤和清除作用。 方法:(1)利用PCR技术从小鼠脾脏淋巴细胞的cDNA中获取截短的CRT和PD1的目的基因并构建pcDNA3.1(+)/CRT、pcDNA3.1(+)/PD1、pcDNA3.1(+)/CRT-sPD1真核表达质粒。(2)将pcDNA3.1(+)/CRT、pcDNA3.1(+)/PD1、pcDNA3.1(+)/CRT-sPD1和pcDNA3.1(+)(阴性对照)质粒转染B16-F1细胞,通过G418筛选后,挑取阳性克隆扩大培养,western blot鉴定CRT、PD1、CRT-sPD1在B16-F1细胞中表达,并利用ELISA法和流式细胞术(FCM)检测融合蛋白分泌到细胞上清中,并能与EL4细胞膜上高表达的PDL1结合。(3)收集转染后各克隆株细胞上清与淋巴细胞混合共培养,MTT法检测融合蛋白对淋巴细胞增殖能力的影响;将CFSE染色后淋巴细胞与稳定表达细胞株共培养,流式细胞术检测淋巴细胞增殖情况及乳酸脱氢酶法检测致后敏淋巴细胞对B16-F1细胞株的杀伤作用。(4)动物实验；将转染后各细胞株分别打入小鼠右背部皮下,观察肿瘤的生长,肿瘤鼠的生存期及抑瘤率;并取各组小鼠的脾脏淋巴细胞与B16-F1细胞株共培养,流式细胞术检测淋巴细胞的增殖和特异性杀伤淋巴细胞数(CD8+和INF-γ双阳性),乳酸脱氢酶法检测淋巴细胞杀伤作用及ELISA法检测淋巴细胞培养上清中分泌INF-γ量;由此判定融合蛋白的抗肿瘤作用的效果。 结果：(1)成功构建pcDNA3.1(+)/CRT、pcDNA3.1(+)/PD1、pcDNA3.1(+)/CRT-sPD1真核表达质粒,经酶切和测序鉴定完全正确。(2)将构建好的质粒转染B16-F1细胞,通过G418筛选后,建立了稳定稳定表达CRT、PD1、CRT-sPD1蛋白的B16/3.1(+)/CRT、B16/3.1(+)/PD1、B16/3.1(+)/CRT-sPD1细胞株及对照细胞株B16/3.1(+)。(3)收集稳定表达分泌性PD-1、CRT及CRT-sPD-1的细胞培养上清,流式细胞仪检测到PD1与CRT-sPD1能与EL4细胞表面的诱导表达的PDL1特异性结合。(4)收集上述的细胞上清刺激脾脏淋巴细胞,发现融合蛋白CRT-sPD-1能够显著的促进淋巴细胞增殖。(5)将上述稳定表达的细胞株与混合淋巴细胞共培养,发现对照细胞株B16/3.1(+)明显抑制淋巴细胞生长,但CRT-sPD-1克隆株能有效的促进淋巴细胞增殖;将这些致敏后的淋巴细胞进行CTL实验,与对照组相比CRT-sPD-1克隆株致敏的淋巴细胞对B16-F1细胞株的杀伤明显增强。(6)肿瘤模型中,CRT-sPD1融合蛋白能够有效的抑制肿瘤的生长,延长肿瘤鼠的生存期。(7)制备各组肿瘤小鼠的脾脏淋巴细胞与B16-F1细胞共培养,CRT-sPD1组小鼠淋巴细胞增殖能力增强,特异性杀伤淋巴细胞数(CD8+和INF-γ双阳性)增多,分泌INF-γ增多,对B16-F1细胞的杀伤能力增强。 结论：(1)建立了稳定表达mCRT-sPD1的细胞株；(2)分泌的mCRT-sPD1蛋白具有结合细胞表面PD-L1及促进淋巴细胞增殖和杀伤的活性；(3)融合蛋白CRT-sPD1能够在体内活化、诱导免疫系统对肿瘤进行特异性的杀伤,起到抑制肿瘤生长、延长肿瘤鼠的生存期的功能,提示CRT-sPD1可作为肿瘤免疫治疗药物的开发利用。