溶藻弧菌珊瑚病原菌株的比较基因组学分析及XSBZ03的快速检测方法建立

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近年来,南中国海的珊瑚礁生态系统日趋瓦解并受到广泛关注。本文首次对该海域的2株扁枝滨珊瑚白色综合征病原菌株XSBZ03、XSBZ14进行了全基因组测序及比较基因组学分析,并基于IGS序列的比对分析,建立了针对XSBZ03的PCR快速检测方法。本研究是将Illumina Hiseq4000高通量测序平台与第三代测序仪PacBio RSII平台相结合,进行细菌全基因组的测序、完成图的组装及相应的生物信息学分析。结果显示,样品XSBZ03的基因组含有5,126个基因,基因组总长度为5,890,205bp,串联重复序列122个,tRNA 134个,rRNA 37个。样品XSBZ14的基因组含有4,705个基因,基因组总长度为5,199,476bp,串联重复序列95个,tRNA130个,rRNA37个。在测序的基础上,对XSBZ03、XSBZ14的全基因组进行了 GO、KEGG、COG及Swiss-Prot数据库注释及基因功能分析,发现了前噬菌体序列以及一些调控系统如T6SS、T3SS、双组份调控系统等。对XSBZ03、XSBZ14的全基因组测序及基因功能分析,不仅充实了溶藻弧菌全基因组数据库,也为探索其致病性、分析其进化历程和环境适应能力等奠定了基础。对包括XSBZ03、XSBZ14在内的6株溶藻弧菌菌株进行了比较基因组学分析。其中核酸序列线性共线性分析表明,XSBZ03、XSBZ14相比于标准菌株来说,基因组均存在着较大的遗传变异,有较大的反转、移位等基因组重排事件。对5株菌(ATCC17749、V1、E0666、XSBZ03和XSBZ14)进行的共有非共有基因的分析,得到共有基因(core基因)3846个,XSBZ03特有基因为690个,XSBZ14特有基因为258个。其中,XSBZ03和XSBZ14菌株共有的特有基因(其他三株菌没有的基因)有47个。对XSBZ03和XSBZ14单拷贝基因家族基因相对于ATCCl7749的Ka/Ks值进行分析,XSBZ03有95个基因Ka/Ks>1,XSBZ14有90个基因Ka/Ks>1。这些基因中的大多数与菌株的致病性密切相关,并且其中的转录调控因子基因很可能成为建立XSBZ03、XSBZ14快速检测方法的特异引物的潜在靶区。另外,根据数据库注释结果及其与他弧菌的已知毒力基因比较,XSBZ03、XSBZ14中存在ToxR、tdh、flaA等毒力因子的相关基因。比较分析还发现XSBZ14的一部分编码周生鞭毛的基因发生了倒位突变。尽管XSBZ14与已有报道的溶藻弧菌一样,只有2套T6SS系统,但XSBZ03有3套T6SS系统,这是首次在溶藻弧菌菌株中发现了 3套T6SS系统。对4株溶藻弧菌菌株(ATCC17749、HN08155、XSBZ03和XSBZ14)的IGS序列的比较分析发现,在XSBZ03的IGSAG-697bp中,存在一小段特异的序列,该序列可以作为建立ZSBZ03快速检测方法的靶区。本研究从基因组水平上揭示了溶藻弧菌珊瑚病原菌株对贫营养环境的生存适应性及其致病性的分子基础,为今后揭示该病原的进化、生存策略和致病机制奠定了重要基础。根据XSBZ03的IGSAG-697bp中的特异序列,设计特异性引物(BZRDF/BZRDR)、优化条件并建立PCR快速检测方法。以来源不同的106株弧菌的DNA为模板,仅XSBZ03产生了目的条带;检测极限为1.68×103 CFU ml-1和1.38ng μl-1。因此,针对珊瑚病原菌株,本文首次建立了高灵敏度的快速检测方法。
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